HiFi測序：單堿基分辨率的高通量端粒長度測量方法

　　端粒是線狀染色體末端的特殊核蛋白結構，包含約5-15 kb的富含TTAGGG的雙鏈重復序列和保護染色體末端的shelterin蛋白復合物，3'末端為富含G的單鏈懸突，對于維持人類基因組的穩定和完整復制至關重要。

　　端粒主要依賴端粒酶進行合成，長度也并非一成不變。除了生殖細胞和干細胞，體細胞由于端粒酶活性的缺乏會導致每次細胞分裂時端粒逐漸縮短(約50-200 bp)。研究表明外周血單核細胞(PBMCs)中與年齡相關的端粒生命早期每年縮短1190 bp，兒童期每年縮短126 bp，成年期每年縮短43 bp。隨著年齡的增長，端粒的縮短從生命早期到成年期逐漸緩慢，當端粒縮到非常短時就會發生功能失調，誘發DNA損傷反應、導致細胞衰老并引發一系列疾病。因此正常人類體細胞中端粒長度的逐漸縮短成為年齡相關疾病的很有希望的生物標志物。但是目前多種端粒檢測技術仍然達不到在單堿基分辨率的情況下實現端粒的高通量檢測或者無法準確定量端粒的長度。因此，在實驗和臨床研究中都迫切需要一種能夠及時縱向檢測個體端粒磨損的高靈敏度方法。

　　在這里，新加坡國立大學Shang Li和Motomi Osato課題組在nature communications上發表了題為“High-throughput telomere length measurement at nucleotide resolution using the PacBio high fidelity sequencing platform”的文章，描述了使用新設計的端粒-DNA序列(稱為"Telobaits")在細胞系和臨床患者樣本中捕獲端粒的工作流程，并使用PacBio HiFi測序以單堿基分辨率實現端粒長度的高通量、準確測定。還揭示了分布在整個端粒重復序列區域的端粒變異序列(TVS)的極端異質性。TVS的存在破壞了典型端粒重復序列TTAGGG的連續性，從而影響了染色體末端shelterin蛋白復合物與端粒的結合和對端粒的保護。這些發現可能對人類衰老和疾病有深遠的影響。

目前的技術限制

　　末端限制性片段(TRF)分析、實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)、高通量單端粒長度分析(HT-STELA)和高通量熒光原位雜交(HT-QFISH)等只能提供端粒的平均長度或相對長度，缺乏單堿基的分辨率。最重要的是，它們缺乏檢測可能對人類衰老和疾病有深遠影響的端粒變異序列(TVS)的能力。

　　長讀長測序平臺可以實現端粒基因組DNA片段的直接測序，獲得單個染色體末端的絕對端粒長度。但是目前的測序方法需要全基因組測序來分析個體的端粒分布，達不到對高通量的需求。而且無法保證末端3 '富含G的懸垂單鏈的完整性。

方法

　　為了克服這些問題，該研究做了以下優化：

　　1. 提取高分子量基因組DNA，使用RsaI和HinfI限制性內切酶進行酶切。

　　2. 設計了6個新的端粒-DNA序列(稱為“Telobaits”)，分別包含可與端粒3'單鏈懸突互補的重復序列、EcoRI限制性內切酶位點和3'生物素標記。

　　3. 用Telobaits捕獲到染色體的末端，然后使用鏈霉親和素偶聯磁珠純化完整的全長端粒基因組DNA片段，EcoRI限制性內切酶酶切后洗脫。

　　4. 在端粒中加入條形碼進一步允許樣品的混樣來提高通量。

　　5. 使用PacBio HiFi測序平臺在單堿基分辨率下進行高通量的端粒長度測量。

圖1. 實驗流程圖

結果

　　1 PacBio HiFi測序對端粒重復序列DNA載體的測序準確性高

　　PacBio HiFi測序平臺基于單分子實時(SMRT)測序實現了平均讀長達10-25 kb、準確度90%>Q30。為了驗證PacBio HiFi測序平臺是否可以作為測量端粒長度的可靠工具，研究人員首先對含有擬南芥端粒5'TTTAGGG-3'重復序列的線性化DNA載體(pWY82)進行了HiFi測序。如圖2a所示，研究人員獲得了質粒的高精度測序數據。DNA載體的CCS reads的平均準確率中位數超過Q40(99.99%)，平均值為Q29(99.87%)。隨后，使用準確度Q20以上的HiFi reads進行比對分析，DNA載體非重復區域的比對精度接近100%，重復區域的比對精度>95%(圖2b)。擬南芥端粒重復序列的單堿基水平的測序錯誤與質粒非重復區域的測序錯誤相似(圖2c)。總體而言，非重復序列區的測序精度優于端粒重復序列區。因此，研究人員驗證了PacBio HiFi測序是一種可靠的端粒DNA片段檢測方法。

圖2. 端粒重復序列DNA載體PacBio HiFi測序。

　　2 PacBio HiFi測序的單堿基分辨率實現端粒長度的準確測定

　　接下來，研究人員使用優化的方法從培養的細胞系中富集含有端粒的基因組DNA片段，使用PacBio HiFi測序進行端粒長度測量。

　　為了準確測定端粒的長度，研究人員重新定義了端粒長度：

　　1.將端粒的5'起始定義為包含至少兩個連續的端粒重復序列TTTAGGG，因為shelterin蛋白復合物的最小結合基序包含1.5個典型重復序列TTTAGGG，端粒的3 '末端為3'單鏈懸突，這之間的距離被稱為原始端粒長度(圖3a)，這與傳統的端粒長度定義(從TTAGGG重復開始到染色體末端)相當。

　　2.考慮到shelterin蛋白復合物，是以序列特異性的方式與典型的端粒重復序列結合，預計會被TVS的存在破壞。因此，研究人員還計算了端粒中僅含有典型TTTAGGG的端粒長度，并將其定義為端粒長度(圖3a)。

　　研究人員測定了從HCT116、293T、T24、IMR90 (PD47)和WI38 (PD40)細胞中提取的端粒DNA片段的絕對長度(圖3b, c)。在單次測序運行或單獨測序運行中，不同生物重復之間平均端粒長度與堿基分辨率顯示出非常高的一致性，表明HiFi測序重復性好(圖3d)。先前的研究表明，T24細胞含有極短的端粒。HiFi測序印證了這一結論，并進一步分析出T24細胞比其他細胞系具有更高比例的極短端粒(<1000 bp)(圖3e, f)。使用PacBio HiFi測序測定的細胞系的原始端粒長度和平均端粒長度與使用TRF測定的端粒長度呈現一致性(圖3g）。

圖3. 使用PacBio HiFi測序測定培養細胞HCT116、293T、T24、IMR90（PD47）和WI38（PD40）的端粒長度

　　為了摸索準確測量端粒長度所需的理想測序深度，研究人員將獨立測序運行的HCT116和293T細胞的不同生物重復測序獲得的reads結合起來進行bootstrap重采樣，計算端粒長度測量平均值的標準誤差(SE)。如圖4b和c所示，測序深度為~20,000個端粒reads足以將平均值的預期誤差降低到± 20nt以下，具有95%的置信度(1.96*SE)。因此，基于HiFi測序設計優化的端粒長度檢測方法的靈敏度足以檢測出成人端粒每年縮短約43 bp。

圖4. PacBio HiFi測序測定端粒長度的理想測序深度。

　　3 PacBio HiFi測序的高通量端粒長度測定

　　外周血白細胞(pbl)或外周血單核細胞(pbmc)的端粒長度經常被用作衰老相關研究的生物標志物。為了應用PacBio HiFi測序進行高通量的端粒長度測量，研究人員用HiFi測序平臺的兩次運行混樣測定了104例患者的PBL樣本。拆分后每個患者樣本獲得了至少2000條HiFi reads。隨后研究人員計算了每位患者的平均端粒長度或原始端粒長度，并檢查了其與年齡的相關性(圖5a, b)。與預期一致，端粒長度或原始端粒長度與年齡的增加呈負相關。這些結果表明PacBio HiFi測序是一種可靠的方法，可以在單堿基分辨率水平上評估端粒長度。

圖5. 患者PBL樣品中的高通量端粒長度測定。

　　4 人端粒G鏈分析

　　研究人員的長讀長端粒測序方法也允許準確分析染色體末端的G鏈。早期研究表明，哺乳動物端粒中的G鏈分析不如四膜蟲精確。而這項研究從患者樣本和培養細胞中獲得的單堿基準確率的PacBio HiFi測序結果足以分析G鏈的末端組成(圖5c)。因此，分析表明人類端粒G鏈的加工過程與在四膜蟲和游仆蟲中觀察到的非常相似，超過60%的G鏈以GGTTAG結尾(圖5c)。

　　5 TVS在端粒區的獨特分布和序列

　　與已有的研究一致，HiFi數據顯示在端粒重復區域存在TVS，并且它們在長度和序列上表現出非常高的異質性(圖6a)，豐度和大小分布也存在非常高的個體特異質性(圖7a)。并且患者PBL樣本中的TVS，長度分布從1到6個核苷酸不等，也并非隨機分布(圖6b)。以Chr.7q為例，在端粒重復區域的亞端粒末端附近，主要包含更大、更豐富的TVS(圖7b)。

圖6. 患者PBL樣本中端粒變異序列（TVS）的獨特長度分布。

　　6 TVS破壞了端粒上shelterin蛋白復合物的結合

　　在人體細胞中，Shelterin復合物由六種蛋白質組成，包括TRF1、TRF2、POT1、RAP1、TIN2和TPP1。典型端粒序列的突變會顯著降低TRF1和TRF2的結合親和力，從而損害了染色體末端保護。因此，當端粒變得非常短時，亞端粒區域附近更大、更豐富的TVS的存在預示著較低的shelterin蛋白結合密度，這可能導致生命后期端粒保護的急劇惡化。

　　為了預示這種現象，研究人員計算了每個患者樣本中所有染色體末端靠近亞端粒區域的典型端粒重復序列的前1kb內TRF1/TRF2結合基序的最大數量。如圖7d所示，研究人員在患者樣本中觀察到該區域TRF1/TRF2結合密度的顯著差異。進一步觀察單個染色體的末端，研究人員注意到來自患者樣本P14和P15的Chr.7q，由于TVS的存在，盡管典型端粒重復長度相同，均為1 kb，但兩條染色體末端具有不同的原始端粒長度(1126 bp vs 1627 bp)和TRF1/TRF2結合位點數量(81 vs 62)(圖7e)。即使僅在染色體一端，TRF1/TRF2結合密度的降低預示著shelterin蛋白復合物對端粒的保護較低，從而增加端粒脫帽的可能性，并在端粒變得非常短的情況下誘導DNA損傷反應，特別是在生命的后期可能對人類衰老和疾病產生深遠的負面影響。

圖7. 個體特異性的TVS的存在可能影響不同人的染色體末端保護。

討論

　　在這項研究中，研究人員提出了一種利用PacBio HiFi測序平臺富集含端粒基因組DNA片段進行單分子實時測序的高通量方法，并證明了長（10-25 kb）而準（90% > Q30）的PacBio HiFi測序是一種可靠的方法，可以在單堿基分辨率的水平上評估端粒的絕對長度，并且足以檢測成人端粒每年縮短約43 bp的速度。還表明了不僅端粒絕對長度，典型端粒重復序列的連續性也是預測一般人群壽命和與衰老相關疾病的關鍵參數。

　　綜上，端粒長度變化可能是一種重要的生物標志物，該方法檢測端粒長度微小變化的靈敏度不僅可以使其成為估計端粒長度變化的重要工具，而且還可以用于開發潛在的干預措施，以減緩未來的人口老齡化。