LED光源在熒光顯微成像中的應用簡述（二）

目前可以使用的LED芯片的功率與100W汞燈泡中等離子弧產生的輻射相差甚遠。燈泡能夠發射極寬譜段范圍的能量，但在給定的約20nm的譜段范圍內，LED更有優勢甚至超過了汞燈泡在360nm至800nm的大部分區域。

LED的過度使用在熒光應用領域非常常見，這使熱量管理變得極為重要。冷卻技術包括珀爾帖（Peltier）冷卻以及將未封裝的LED芯片放置在大型銅散熱片上。

長期以來，光譜的綠光區域與燈泡相比最弱，這部分區域在固態照明中被稱為“綠色空白”，也是LED光譜中極其微弱的區域。研究人員可以通過采用多種形式的熒光材料來解決這一問題。一種由飛利浦公司（Philips）取得ZL權的方法使用由一系列明亮藍色LED組成的熒光棒。與單個LED相比，在常見的熒光顯微鏡上使用這種方法會增加成本且實用不方便。對藍色LED芯片功率的最新研究提出了更為簡單的解決方案，即在LED上直接放置熒光劑，且只選擇能夠提供最大綠色光譜區域的熒光劑。圖3中展現了由明亮綠色LED通過斯托克斯位移激發的紅色光。

圖3. 使用熒光標記的牛肺動脈內皮細胞。藍色區域為細胞核，綠色區域為微管蛋白，紅色區域為肌動蛋白。圖片來源：Jordi Recasens/Izasa Scientific。

成像增強

顯微鏡的最終目標是獲取優質的圖像。然而，由于光毒性的影響，樣品觀測對實驗來說至關重要。通過提升LED的固有屬性可以同時改善圖像信噪比以及成像的反作用。

金屬鹵素燈引入后，充液燈開始廣泛使用，消除了為提高照明均勻度而校準燈泡的需要。這種均勻度的改善為制造性能良好的光擾頻器起到了指導性作用。LED由于其固態特性可以直接與顯微鏡連接，無需重新校準，并采用柯勒（K?hler）照明——一種現代科學光學顯微鏡樣品照明技術。利用這種方法，光源中的光學器件可將LED成像到顯微鏡物鏡的后孔徑上。這種反向工作的物鏡能夠在樣品的完整視野內均勻地分散光線。然而一些LED仍與導光板一起使用，以減輕顯微鏡的重量和振動。

具有良好的阻擋和反射區域的濾光片能夠改善圖像的信噪比。在用于普通4',6-二脒基-2-苯基吲哚熒光（DAPI）成像（圖4）的激發和發射濾光片中，激發濾光片需要阻擋汞（Hg）光譜大部分藍色區域的能量。

圖4表示使用示例性的激發和發射濾光片覆蓋385nm LED的光譜以及DAPI吸收和發射的Hg光譜。

相比之下，用于激發DAPI的LED在相應的激發帶上產生了極低的能量，包括在相對較弱的樣品成像的藍色區域。對比結果為，使用LED作為光源能夠獲得更好的圖像信噪比，因為LED光源能夠減低樣品的背景水平。愛丁堡大學的Sandrine Prost及其同事們的研究表明采用波長可控制的獨立LED光源，其信噪比的提高超過了燈泡系統，甚至超過了其他一些白色寬光源LED。

由于細胞不能暴露在高強度光下，因此觀測樣品也會影響到觀測結果。觀測樣品導致的反作用包括光漂白和光毒性，導致隨著時間推移信號減弱和活細胞的死亡或由照明引起的操作不當。減少樣品的照明時間對降低這些反作用的影響至關重要。傳統燈泡光源通過機械快門來控制曝光，這種方法有時會造成長時間的延遲，導致樣品在曝光時被不必要地照亮。

使用自動控制的LED光源則可以解決這個問題。LED的直接TTL控制通過提供以微秒計算時間的開/關來完善USB通信方式。許多高端攝像機在相機曝光時使用TTL輸出信號，該信號能夠與相機曝光精確配合，直接饋送至LED光源控制開關。由于兩至三個熒光標記的順序成像很常見，所以最新的LED將波長的階躍序列編程到光源中，隨著每個照相機的順序進行曝光。對于這種電路連接方式，不需要實時操控機械控制的快門以及電腦控制模塊，因而減少了不必要地樣品曝光。

最近，麥吉爾大學的Claire Brown及其同事們的研究表明，通過控制樣品曝光量，光漂白及光毒性的影響將大大降低。一個熒光原子吸收一個光子后將進入受激單能態，理論上將釋放自身大部分的能量，激發出一個更長波長的新光子。然而，熒光原子也有可能進入有毒的三線態。如果處于三線態的熒光原子吸收了更多的光子，則額外的能量會使共價鍵的斷裂。這種方法同樣有助于降低光毒性和光漂白效果。

在使用快速線掃描法（可用于共焦系統）的激光激發研究中，光漂白和光毒性的影響同樣被顯著降低。因為短時間內受限的脈沖在曝光后進入間歇周期，使三線態的分子能夠返回到穩定的基態。這方面的研究工作將繼續進行，由于LED的可控性以及快速開關切換能力，預期以LED作為光源也能得到相似的結果

340nm的大功率LED已經在近期投入市場使用，其采用鈣熒光指示劑（Fura-2）進行鈣成像。該應用通過獲取神經元網絡的活動信息進行阿爾茲海默病及其他相似病癥的研究。斯特拉思克萊德大學的Peter Tinning及其同事們的研究表示，使用340nm或380nm的強LED系統可以使細胞中鈣熒光指示劑濃度比標準細胞制備方案低25%。

該研究不僅為實驗研究節省了資金，更重要的是，能夠降低熒光標記可能導致的細胞毒性效應，以觀測到生物樣品更為典型的自然行為