LSCM免疫熒光染色

免疫熒光染色

使用預冷的 PBS 緩沖溶液洗滌細胞，去除殘留的培養液。立即加入 4% 多聚甲醛(PFA)固定液。在室溫固定15 min。用 PBS 洗滌殘留的固定液后，用 0. 5% Triton X-100 處理細胞 5 min，這樣可以通透細胞膜，使抗體等大分子能通過細胞膜，進到固定細胞的內部。但這樣處理會破壞細胞膜。

PBS 洗去通透溶液。在含有 1% BSA 的 PBS 溶 液中孵育細胞，常溫封閉細胞 30 min。其目的是封 閉細胞和玻璃片，減少抗體的非特異性吸附，從而減 弱背景。如果僅使用熒光標記的小分子或化合物， 可不進行此步驟。一抗結合。把抗體稀釋到含有1% BSA的PBS溶液中，孵育細胞1 h或4 °C過夜。抗體的使用濃度一般為0.1~10μg/mL。由于不同的抗體親和性和識別能力不同，應根據抗體的性質進行調整。用含有 1% BSA 的PBS 溶液洗滌細胞 3次，每次 5 min，以去除多余的抗體。再使用熒光標記的二抗或染料，稀釋在含有 1% BSA 的 PBS 溶液中，室溫孵育 1 h。整個過程需要注意避免強光，防止熒光基團的淬滅。再用 PBS 洗滌玻璃片，去除殘留的熒光染料或者抗體。最后去掉玻璃片上多余的PBS，并用封片劑封片。待封片劑凝固后，即可進行激光共聚焦顯微鏡觀察。