Lowry檢測法測定蛋白質濃度實驗

Lowry 法又稱為 Folin-酚試劑法。首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復合物，然后這一復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑 （Folin-酚上級），產生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色，這種深藍色 的復合物在745～750 nm 處有最大的吸收峰，顏色的深淺（吸收值）與蛋白質濃度成正比，可根據 750nm 的光吸收值大小計算蛋白質的含量。

待測蛋白質樣品

五水硫酸銅 檸檬酸 碳酸鈉 NaOH Folin-酚試劑

分光光度計 比色杯 移液管 槍頭和加樣槍 試管（3～5 ml） 試管架 震蕩器

1. 溶液

1.1 溶液 A，100 ml

0.5 g CUSO₄·5H₂O

1 g Na₃C₆H₅O₇（·2H₂O）

加雙蒸水至 100 ml， 溶液可長期保存于室溫。

1.2 溶液 B，1L

20 g Na₂CO₃

4 g NaOH

加雙蒸水至 1 L， 溶液可長期保存于室溫。

1.3 溶液 C，51 ml

Folin 溶液A

50 ml 溶液B

1.4 溶液 D，20 ml

10 ml Folin-酚試劑

10 ml 雙蒸水

2. 檢測

2.1 用雙蒸水稀釋樣品至 0.5 ml；

2.2 加 2.5 ml 溶液 C；

2.3 混勻在室溫下放置 5～10 min；

2.4 加 0.25 ml 溶液 D， 混勻；

2.5 20～30 min 后，在分光光度計上測 A₇₅₀ 值。

3. 從干擾物質中純化蛋白質樣品的附加步驟

脫氧膽酸-三氯醋酸（DOC-TCA）沉淀法。此法可在測定蛋白質的溶液濃度低于 1 ug/ml 情況下使用。

所需試劑：0.15 ％ （w/V）DOC：72 ％ TCA

3.1 于 1 ml 蛋白質樣品中加入 0.1ml 0.15 ％ DOC；

3.2 震蕩后在室溫放置 10 min；

3.3 加入 0.1 ml 72 ％ TCA， 搖勻后，1000～3000×g 離心 5～30 min。如使用固定角轉頭，以及低溫或大體積則需較長時間離心；

3.4 傾斜，吸棄上清液；

3.5 直接用溶液 C 溶解沉淀。

1. 在加入試劑 20～30 min 后呈色達到飽和，此后每小時顏色信號減弱 1 ％。

2. 許多干擾物質降低顏色反應，而去垢劑引起顏色輕微升高。

3. 高濃度鹽可引起沉淀。

4. 氯仿抽提可去除溶液中的脂質，在 K^＋ 或 Triton X-100 存在時可通過離心去除混濁物。

5. 去垢劑，蔗糖和 EDTA 的干擾可通過在 Lowry 試劑中加入 SDS 來消除。

6. —般情況下，蛋白質-染料復合物的消光系數 ≤ 1.2。