MALDI成像技術在跨學科中的應用：從代謝組學到殺蟲劑

　　基質輔助激光解吸/電離（MALDI）成像質譜法能以直接、原位、無標記的方式測量組織中的蛋白質、多肽、脂質、小分子藥物及其代謝物和其它化合物。應用范圍覆蓋基礎生物學研究、環境和毒理學科學，以及專門的藥物研發方法。在各種情況下，MALDI成像所產生的獨特信息對理解包括人、動物和植物等各類生命體的各種重要因素，如分子和代謝機制，以及化合物或代謝物轉運和定位，都能作出重要貢獻。本文將用MALDI成像技術著重研究諸如十氯酮等殺蟲劑如何長期影響人類健康，并在補救和環境政策的立法、政治和經濟決策提供支持性證據。

　　1. 介紹

　　在過去十年中，對高靈敏度、超快速質譜技術的需求激增，推動了一系列的質譜儀的創新，并將其應用擴展到了更多的領域，包括藥物研發、OMICS 研究、藥物代謝和環境科學。現在，質譜儀在傳統分析實驗室之外很常見，不同的電離源——如直接基質輔助激光解吸/電離（MALDI）——的出現推動了蛋白質組學和質譜成像的諸多進展。

　　MALDI成像——20世紀90年代末，Caprioliet 等[1] 首次強調這項技術，作為研究哺乳動物組織切片中生化過程的高靈敏度工具，對分子生物學領域，特別是在研究包括人類、動植物在內的生物系統中化合物和代謝物的轉運和定位方面，做出了重大貢獻。

　　2. 集成生物學與化學

　　MALDI成像能以直接、原位、無標記的方式測量組織中的蛋白質、多肽、脂質、小分子藥物及其代謝物和其它化合物。Caprioliet等的早期實驗展示了對大鼠胰腺和垂體區域的MALDI離子圖像分析。一些多肽只在局部觀察到。同時，作者還注意到，在大鼠垂體組織的一副質譜圖上，觀察到超過50個相互關聯的離子，，他們均為某一個多肽的前體、亞型和代謝碎片。

　　最近，Journal of Proteomics（《蛋白質組學雜志》）發表了一篇綜述文章，介紹了MALDI成像在環境污染物毒理學評價中的潛力。作者的結論是，MALDI成像在研究釋放到環境中的化學物質的分布和代謝，以及更好地闡明其作用機制方面具有巨大的潛力。

　　根據應用需要，可以將一系列質譜儀集成到MALDI成像系統中。例如，MALDI-Time-of-Flight（TOF）系統可提供高通量（對分子量類似的分子的辨別能力較低），而磁共振質譜儀（MALDI-MRMS）則具有較高的測量精度和質量分辨能力。

　　3. MALDI 成像在制藥研發與癌癥研究中的應用

　　縱觀21世紀初，MALDI 成像沿著兩條平行的軌道發展：作為生物學家的一種研究工具，人們的興趣持續增長；同時，有關它在藥物研發（R&D）中應用的第一批材料面世。

　　藥物研發中進行安全和有效藥物風險評估的傳統方法，是基于測量動物模型和人類血漿中的原型藥物。然而，人們已經認識到，大多數藥物靶標并不在血漿中，而其在相關組織分布的測定既要包括原型藥物，還應包括其代謝物，這將將使人們對藥理學和毒理學有更多的了解。

　　定量全身放射自顯影（QWBA）和液相色譜聯用質譜（LC-MS）是研究藥物在體內分布的最佳實踐方法，而他們現在明顯將重點放在分析組織而不是血漿上，但仍未能提供完整的結果。這兩種技術都存在挑戰。QWBA是一種穩健的方法，所產生的數據被世界各地的監管機構所接受。但是，它需要使用放射性標記探針，并呈現出體內總放射性物質的總和，包括原型藥物、代謝物、雜質和降解產物的各種組合。

　　LC-MS分析的對象是組織勻漿提取物。這項技術不能提供任何空間信息，更重要的是，它可能會產生誤導。例如，如果組織中的被分析物高度局部化，提取和均質過程將起到稀釋作用，從而掩蓋這種分布，并使濃度相對較低，有時甚至低于檢測極限。

　　在此背景下，MALDI成像為藥物開發提供了潛在的優勢。例如，MALDI成像能提供藥物及其重要代謝產物在組織樣本中定位的重要新信息。圖2突出顯示了S.Castelinoet 等于2011年發表的早期工作[3]：通過放大，可以找出組織切片中的炎癥區域。對應于相同放大區域的MALDI成像圖（50μm空間分辨率）表明，拉帕替尼代謝物M10只出現在炎癥相關的區域。

犬肝臟切片組織學和MALDI成像的相關性

　　此外，MALDI成像技術也有助于開發新的疾病生物標志物，特別是在癌癥研究領域。在這里，癌癥樣本的異質性意味著，由于樣本的空間分布和組織學信息得到保留，MALDI成像非常適合這項工作。重要的是，MALDI成像已經成功地應用于檢測癌癥中先前未知的蛋白質，以及在蛋白質N-和O-糖基化的生物標志物發現方面的最新進展。在這類研究中，MALDI成像已被用于開發腫瘤特異性聚糖生物標志物，這些標志物有望在癌癥組織中表征N-連接聚糖[4]。

　　4. 儀器的進步推進了生物學的新前沿

　　重要的是，盡管MALDI成像與制藥的關聯最為人所知，但MALDI成像的藥物應用僅包括早期采用該技術的一個領域。大約在制藥行業初步工作開始的同時，法國的幾個研究所正在使用MALDI技術來深入了解環境毒素對糧食供應中的再生產、化學相互作用和結構的影響，并評估為污染土地的生物修復而設計的植物。

　　其中一個由Charles Pineau領導的研究小組，一直在使用MALDI成像技術，并將其應用于研究發育和生殖生物學、環境以及化學毒性。Pineau是Inserm（法國國家健康與醫療研究所）的研究總監，同時也是IRSET（環境與職業健康研究所）的團隊負責人。作為他在IRSET的職責的一部分，他也是Protim實驗中心的總監，Protim實驗中心涉及優化和驗證蛋白質組學中兩個領域的新技術：復雜樣品的蛋白質組深度表征，以及毒理學和臨床MALDI成像。

　　5. 協作推動卓越成像

　　Protim參與了歐盟資助的兩個合作項目：“3D MASSOMICS”和“METASPACE”

　　最近完成的研究項目“3D-MASSOMICS”是歐盟FP7健康計劃的一部分，旨在利用MALDI成像技術實現3D無標記蛋白質組學和代謝組學成像[5]。傳統的三維成像技術如CT、MRI和PET不能用于蛋白質組學和代謝組學發現研究，也不能用于生物標志物發現和疾病途徑分析。為了應對這一重大挑戰，該聯盟聯合了來自6個國家和地區的工業和研究領域的9個合作伙伴，包括Protim，開發可重復采集3D MALDI成像數據的統計方法，以及對該數據進行有監督(或無監督)的統計分析和解釋。

　　該聯盟協調人Palmer和Alexandrov[6]進行的審查，旨在評估并增強分析領域對3D質譜成像的認識，和加速該分子成像工具的創新。審查結果表明，縮短采集時間對三維質譜成像的發展具有重要意義。當采用快速質量分析器（如TOF或QTOF技術）以及2-5 kHz的高頻激光器時，要求高加速、高精度定位的逐像素數據采集方法成了瓶頸。據報道，先進的高性能質譜成像系統使用5-40 kHz激光器，提供每秒20像素的采集速度。

　　作為歐盟Horizon 2020研究和創新計劃的一部分，METASPACE是Protim正在進行的一個項目[7]。它是一個專門的平臺，承載MALDI成像數據的代謝物注釋引擎，整合了學術界提供的數百個公共數據集的空間代謝物知識庫。METASPACE平臺由歐洲分子生物學實驗室（EMBL）Alexandrov團隊的軟件工程師、數據科學家和質譜專家開發。作為該項目的一部分，成像質譜法被應用于空間代謝組學分析，目的是在高質量分辨率質譜成像中創建一個用于自動代謝產物注釋的生物信息學工具[8]。已建立起一種可有效挖掘10  -100 GB數據集的算法，注釋結果如圖3所示。

顯示三組來自大鼠腦冠狀部的MALDI FTICR成像數據集的FDR控制分子注釋（HMDB, FDR 期望值 = 0.1）：a）維恩圖顯示了已注釋的分子數和在三個數據集中都注釋的的十個分子；b）四個注釋的分子的質譜成像圖（全部十個注釋分子的詳細信息參見表SD1.2），以及FDR曲線：f）與單獨考慮的精確質量濾波和空間混沌測量相比，MSM的優越性，以及g）采用較大m/z公差信號模擬退化的質量精度和分辨率時，分子注釋可靠性降低。（補充數據 2，〔8〕）

　　6. 有關人十氯酮暴露的分析

　　除了3D-MASSOMICS和METASPACE項目，Pineau的研究小組在Protim還有許多活躍的項目，研究接觸環境中的化學物質對人體健康的影響。傳統上，來自美國環境保護署（US EPA）和其它官方機構的限制和指導原則規定了可接受的有毒化學品環境水平。根據毒素類型和基質（如空氣、水或土壤）的不同，分別采用專用的環境化學方法（ECM）檢測以符合上述限制，如氣相色譜法（GC）和液相色譜法（LC）。通常與電子捕獲檢測器（ECD）方法一起使用（所有技術與ECM方法的完整列表可在 [9] 中找到）。然而，這些數據并未揭示出這些物質在環境中可能對人類健康產生的潛在影響及其機制。

　　法國Rennes（雷恩）的幾個IRSET小組正在分析殺蟲劑十氯酮。直到1993年，這種殺蟲劑一直在Martinique（馬提尼克）和Guadeloupe（瓜德羅普）用來對付香蕉象鼻蟲。十氯酮是一種已知的內分泌干擾物和致癌物，自1990年起在世界范圍內禁止使用。在禁令實施之前，法屬西印度群島有相當一部分人口暴露于該化學物質，土壤和沿海水域也受到污染。

　　流行病學家Luc Multigner（IRSET研究所的一名小組負責人）2010年發表于Journal of Clinical Oncology（《臨床腫瘤學雜志》）上的初步研究證實，十氯酮能顯著增加患前列腺癌的風險，這正是兩個島上一半的癌癥患者為前列腺癌的原因[10]。

　　同時，Protim的團隊正在開發新的激光技術來提高MALDI成像的分辨率。2011年的一份突破性研究成果首次表明，有可能在商用儀器上以20微米的分辨率獲取10 kDa范圍內蛋白質的MALDI圖像[11]。以大鼠睪丸為相關模型，證明該分辨率得到的質譜成像與細胞水平上的復雜解剖特征相符。分子信號與生精上皮內生殖細胞的發育建立起了良好的相關性。

　　這種靈敏度水平被認為對于下一階段十氯酮研究、以及研究十氯酮在體內的定位并直接在組織樣本上定量十分關鍵。開發小分子毒理學評價的MALDI成像技術需要可靠定量方法。然而，有幾個因素決定了MALDI成像定量分析十分復雜。首先，組織切片中的內源性物質會影響感興趣離子的強度，并可能導致在整個切片的不同位置的電離效率不同。第二，基質結晶的異質性會引起信號的變化。最后，根據所研究分子的理化性質和基質溶液組成的不同，在噴灑基質的過程中產生的感興趣化合物的提取效率會有所不同。

　　Pineau的團隊能夠開發一種強有力的方法，直接在組織切片上進行原位定量，結果發表于2014年[12]。圖4顯示了在十氯酮和CCl4處理的小鼠肝臟病理切片中得到證實的十氯酮原位絕對定量結果（ISAQ）。

十氯酮和CCl4處理小鼠肝臟病理切片中十氯酮的原位絕對定量。（A）H&E染色顯微圖像。（B）對應于十氯酮水合物的MALDI成像：在分析區域內測得十氯酮的平均絕對量為355 μg/g。（C）在各個壞死區域測得的局部絕對量低于在健康組織的測量值（381 μg/g）。組織切片上內標(m/z 516.71)的均勻分布證實了十氯酮的差異分布并非由于離子抑制效應所致。

　　該小組成功地開發了一種通過MALDI成像定量小分子的方法，它基于將標記歸一化與MALDI成像和氣相色譜相關曲線的計算作為常規定量技術。該方法已成功地應用于小鼠肝臟中十氯酮的定量分析，是MALDI成像應用于組織中殺蟲劑定量分析的第一例。

　　雖然這項研究是MALDI成像能力的重要進步，但由于十氯酮的半衰期為30年，因此Guadaloupe的環境污染預計還將持續500余年。科學家繼續監測島嶼上的不同人群，以評估十氯酮對男性生育能力、兒童發育和行為的持續影響。例如，關于接觸十氯酮對妊娠期和早產風險的影響的研究發現。無論何種分娩方式（自發或誘發），母體接觸十氯酮與妊娠期較短和早產風險增加密切相關。十氯酮的激素、雌激素和孕激素特性被認為是導致這種聯系的原因[13]。

　　7. 利用3D成像提高精子形成的知識

　　除了對十氯酮和其它有毒化合物（例如雙酚A和草甘膦）影響的研究外，Pineau和Protim團隊還為MALDI成像在人類生殖生物學中的更廣泛應用做出了貢獻。Pineau擁有30多年的經驗，是精子形成方面的著名專家。他為蛋白質組學和綜合蛋白質組學技術的發展、及其在睪丸病理生理學和生殖毒理學應用領域中解答生物學和臨床相關問題方面作出了重要貢獻。現在，MALDI成像在他進一步研究精子成熟的復雜過程中起著關鍵作用。

　　附睪是位于睪丸旁的一個小器官。睪丸內形成的未成熟精子，形態完整，但缺乏功能。配子通過附睪傳遞，在成熟過程中獲得動力和受精能力。核基因轉錄在精子成熟階段被關閉。因此這個過程是由一系列與復雜的附睪管腔微環境密不可分的連續蛋白質修飾所驅動的。在精子經歷從頭段到尾段的過程中，其子域發生了許多生化事件，包括翻譯后修飾、蛋白水解過程、蛋白質重新分布和消散、新成分的整合，從而導致精子表面的動態重塑。

　　MALDI成像在原位顯示分子的獨特能力，大大促進了對這一復雜生物學的研究，使之比以往任何時候都更容易獲得。圖5顯示了大鼠附睪頭部的2D MALDI成像圖，顯示的一些多肽可能與精子在通過器官過程中的成熟有關[14]；圖6展示了Pineau的實驗室的最新工作——3D MALDI成像圖的創建[15]。構建一個器官的3D MALDI成像模型的過程始于在該器官上制作數百（或數千）個切片。對每一部分進行測量，將數據在軟件中組合起來，以生成最終的圖像。產生的數據集很大（達到TB水平），但一旦完成，數據集就能被用于信息挖掘，可使用多年。

MALDI成像質譜法測定大鼠附睪精子轉運的分子圖像。可以同時觀察到在附睪轉運過程中與精子成熟的相關的許多多肽。分別以不同的顏色顯示了三種與特異性多肽，m/z 5470、6177和18746，相對應的信號疊加。必須使用80微米的橫向圖像分辨率來解析器官結構。

　　總結

　　MALDI成像已經成為一種可提供深入了解組織中多肽、蛋白質和小分子局部分布的技術。應用范圍涵蓋基礎生物學研究、環境和毒理學科學，以及專門的藥物研發方法。在每一種情況下，MALDI成像所產生的獨特信息對理解各種重要因素，如分子和代謝機制，以及人類、動植物物種的化合物或代謝物的轉運和定位，都能作出重要貢獻。正如本文所強調的，MALDI成像還可以顯示十氯酮等殺蟲劑如何長期影響人類健康，并為環境立法以及有關補救和環境政策的政治和經濟決策提供支持性證據。可以說，MALDI成像系統的不斷改進使其更易獲得、更可靠和更易于使用，數據分析變得更加復雜和自動化——MALDI成像在未來幾年將發揮越來越重要的作用。

大鼠附睪頭部3D質譜成像圖。有限質量范圍（m/z 250至m/z 1650）的SCiLS軟件中的PLSA計算。左：m/z對應于血管輸出區的代謝物。右：m/z對應于沿小管顯現的代謝物。

　　鳴謝

　　這項工作部分得到了以下人士的支持：Charles Pineau博士，Inserm研究主管和Protim中心實驗室總監；Richard M. Caprioli，田納西州納什維爾Vanderbilt大學醫學院生物化學、化學、藥理學和醫學系教授；Hélène Rogniaux博士，法國國家農業研究所（INRA）生物聚合物、相互作用、組裝（BIA）研究工程師；以及Dimitri Heintz博士，法國斯特拉斯堡的成像質譜平臺PIMS代謝組學實驗室（IBMP）負責人。

　　關于作者

　　Shannon Cornett博士，Bruker Daltonics成像業務經理；Mike Easterling博士，Bruker Daltonics成像質譜經理；Charles Pineau博士，Inserm（法國國家衛生與醫療研究所）研究總監，Protim實驗中心總監。

　　參考文獻

　　(1) R.M. Caprioli, T.B. Farmer, and J. Gile, Anal. Chem. 69(23), 4751–4760 (1997).

　　(2) M. Lagarrigue, R.M. Caprioli, and C. Pineau, J. Proteomics 144, 133–139 (2016).

　　(3) S. Castellino, M.R. Groseclose, and D. Wagner, Bioanalysis 3(21), 2427–2441 (2011).

　　(4) M.J. Kailemia, G. Xu, M. Wong, Q. Li, E. Goonatilleke, F. Leon, and C.B. Lebrilla, Anal. Chem . 90, 208–224 (2018)

　　(5) 3D-MASSOMICS, University of Bremen, http://eu3dmassomics.uni-bremen.de.

　　(6) A.D. Palme and T. Alexandrov, Anal. Chem. 87, 4055–4062 (2015).

　　(7) METASPACE http://metaspace2020.eu/#/about.

　　(8) A. Palmer, P. Phapale, I. Chernyavsky, R. Lavigne, D. Fay, A. Tarasov, V. Kovalev, J. Fuchser, S. Nikolenko, C. Pineau, M. Becker, and T. Alexandrov, Nature Methods 14, 57–60 (2017).

　　(9) Environmental Chemistry Methods (ECM), Analytical Methods and Procedures for Pesticides, (U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C.) https://www.epa.gov/pesticide-analytical-methods/environmental-chemistry-methods-ecm-index-0-9.

　　(10) L. Multigner, J.R. Ndong, A. Giusti, M. Romana, H. Delacroix-Maillard, S. Cordier, B. Jégou, J.P. Thome, and P. Blanchet, J. Clin. Oncol. 28(21), 3457–3462 (2010).

　　(11) M. Lagarrigue, M. Becker, R. Lavigne, S-O Deininger, A. Walch, F. Aubry, D. Suckau, and C. Pineau, Mol. Cell. Proteomics 10(3), M110.005991 (2011).

　　(12) M. Lagarrigue, R. Lavigne, E. Tabet, V. Genet, J.P. Thomé, K. Rondel, B. Guével, L. Multigner, M. Samson, and C. Pineau, Anal. Chem. 86, 5775-5783 (2014).

　　(13) P. Kadhel, C Monfort, N. Costet, F. Rouget, J.P. Thomé, L. Multigner, and S. Cordier, Am. J. Epidemiol. 179(5), 536–544 (2014).

　　(14) Protim, https://www.protim.eu/index.php/en/.

　　(15) R. Lavigne et al., in preparation.

　　本文翻譯自：http://www.chromatographyonline.com/use-maldi-imaging-mass-spectrometry-interdisciplinary-research-metabolomics-pesticides?pageID=1