MALDITOFMS在突變檢測中的應用

　　近年來隨著精準醫療的需求，臨床中提出了越來越多的檢測需求。以非小細胞肺癌為例，EGFR、KRAS、BRAF、ALK、ROS1、RET、MET、HER-2已經成為臨床中常用的檢測需求。

　　目前檢測中，常以熒光定量方法檢測mutation，FISH方法檢測fusion，或者采用NGS技術進行檢測。EGFR需要檢測的位點散布在18、19、20、21號外顯子上，采用熒光定量方法往往不能在一個反應體系中進行檢測，需要多個反應來完成一個樣本的EGFR基因檢測，對樣本量有一定的需求，且由于熒光定量方法需要根據CT值進行結果的判斷，當CT值在35~40個循環時，往往很難判斷。

　　利用NGS技術檢測在樣本量不足以支持一次運行時，成本往往偏高，且整個NGS的流程往往需要3~5天時間方可得到實驗結果，對于報告的速度有一定的限制。那么有沒有一種技術在檢測位點較多時還可以保證以一個較快的時間較低的樣本個數需求完成檢測呢？

　　MALDI-TOFMS是一個較優的解決方案。主要由基質輔助激光解吸電離離子源（MALDI）和飛行時間質量分析器（TOF）組成。其原理是利用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。

　　而后離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比 ，檢測離子。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準確度高及分辨率高等特點，為生命科學等領域提供了一種強有力的分析測試手段，并正扮演著越來越重要的作用。

　　基于MALDI-TOFMS技術的MassARRAY系統是使用質譜分析精確測量PCR衍生的擴增子的非熒光檢測平臺。質譜分析與終點法PCR相結合，在通用的循環條件下實現了高度多重性的反應，以提供精確、快速且經濟高效的分析。MassARRAY系統利用有限的加入樣本為靶向基因檢測提供了獨特的解決方案。

　　主要流程分為PCR Reaction——iPLEX Extension Reaction——Mass Spectrometry Analysis首先通過普通PCR擴增得到目的區段，而后通過在待測位點上游1bp位置延伸引物進行1bp的延伸反應，使產物形成末端為突變型位點/野生型位點的片段，最后將產物進行MALDI-TOFMS檢測，最終質荷比（M/Z）與飛行時間成正比例的關系即可得到樣本在特定位點的變異情況。

　　MassARRAY系統，配合相應的試劑，可測試各種類型的樣本，包括FFPE、cfDNA、基因組DNA等。

　　此外：

　　· 較高的靈活性：每孔可進行 10-50重PCR反應，最高可達60重。

　　· 高性價比：同時測定10-50個SNP位點，無需熒光標記，耗材成本和樣本用量最低。

　　? 高準確度：通過正反雙向設計引物，能有效檢測插入缺失INDEL和融合基因。

　　? 超高靈敏度：液體活檢，從血漿cfDNA中檢出0.1%腫瘤體細胞突變。

　　? 高樣本通量：每天可處理樣品數 3,000以上，100,000個基因分型。

　　? 低DNA樣本量和質量要求：每組PCR 反應只需10 ng DNA，可以檢測FFPE石蠟包埋的降解至100bp的樣本。

　　? 高質量數據：全自動分析數據，完成基因分型報告，并賦予質譜獲得樣品狀態及結果可信度分析。

　　? 甲基化檢測：單個反應可定量檢測500-600bp片段上的多個CpG位點的甲基化頻率。無需設計CpG位點特異性引物，全自動化數據報告。可對整個啟動子的CpG島上的甲基化作定位、定量分析。