NGS測序中DNA質量對建庫結果的影響

NGS測序中的常規類文庫主要針對全基因組測序，廣泛應用于各類物種的重測序、遺傳變異檢測、BSA性狀定位、遺傳圖譜構建、群體進化、全基因組關聯分析、質粒&線粒體&葉綠體測序、宏基因組測序、小片段測序等領域。NGS測序涉及提取、建庫、上機多個環節，每一步都會影響最終的數據質量。很多老師在收到質檢報告后，對于DNA質量的判定存在疑惑。因此，小編梳理了整個建庫環節中DNA質量對后續影響的問答，幫助老師更好的理解DNA與建庫結果的關系。

Q1、常規類文庫的建庫流程。

根據不同實驗要求，各步驟相應調整，整體流程如下：

片段化→純化→末端修復&末端加dA→連接接頭→純化→片段分選→擴增→純化→定量→庫檢

Q2、影響建庫成功率的因素有哪些？

主要是DNA的濃度、總量、純度、完整度等。常規類文庫一次建庫需要投入200ng的DNA。如果純度較差或總量不足，就可能會使最終文庫的濃度不滿足上機要求。

Q3、DNA主帶很清晰，并且沒有降解，為什么還會有100bp的小片斷核酸？

提取過程中未去除徹底的降解或游離的DNA、RNA小片段核酸。

圖一 2號樣品小片段核酸嚴重

Q4、100bp處的小片段核酸會影響后面的建庫上機嗎？需要額外純化嗎？

對于常規文庫而言，如果DNA主帶完整，降解程度不高，不需要額外的純化，少量小片段核酸會再后續建庫過程中被純化掉。對于一些特殊文庫，小片段核酸可能會有一定的影響，建議去除。

如果小片段核酸殘留特別嚴重，DNA的實際濃度會與測定濃度偏差較大，造成投入量不準確，且后續建庫過程中很難將這些小片段核酸完全純化掉，影響文庫的后續質量，進而影響測序數據的質量。

Q5、DNA的純度會對建庫上機有什么影響。

DNA提取原樣中的多糖多酚、次生代謝物、各種礦物質或有機物質，都會造成DNA中含有各種雜質。DNA中存在這些雜質就會影響建庫過程中的酶促反應、文庫定量的準確性、下機數據的質量，導致文庫建庫失敗或最終下機數據不理想。這就是為什么如果樣品雜質含量高的情況下會建議先純化再建庫的原因。

圖二1-4號樣品膠孔雜質嚴重

Q6、DNA樣品中存在RNA污染，會影響建庫嗎？

如果樣品中存在RNA污染，建議老師做RNA降解的處理。一方面，這會影響實際DNA的濃度；另一方面，可能會有部分RNA被連上接頭并最終測序。這樣會導致下機數據不理想或在過濾數據的時候造成浪費。

圖三 1-6號樣品存在RNA污染

Q7、DNA的降解對建庫上機有什么影響？

如果在樣品獲取、保存、提取過程中處理不當可能會使最終得到的DNA存在一定程度的降解。如果DNA存在降解，主要在于樣品的采集方式、保存環境不當，樣品經過反復凍融；也可能是被細胞中自身存在的的酶降解。這種降解常帶有序列偏好性，會對后續的下機數據分析（比如序列拼接等環節）產生不同程度的影響。

圖四1-3號樣品嚴重降解

Q8、一次建庫需要多少總量的DNA，最低總量多少成功率較高？

不同文庫的建庫起始量不同，常規PE文庫、Metagenome文庫一次建庫起始量要求200ng以上。很多時候由于樣品珍貴，導致實際建庫過程中無法滿足正常起始量的要求，也可以采取風險建庫的方式建庫，通常判斷等級為C等級的樣品總量雖然不滿足正常一次建庫要求但建庫成功率高。

Q9、樣品來源珍貴，總量較少，很難達到常規建庫要求怎么辦？

很多受到來源的限制的樣品DNA總量非常低，推薦構建微量基因組文庫（可以參考“微量基因組建庫方案介紹”，最終數據結果和常規文庫是基本一致的）。微量基因組文庫的建庫起始量最低要求為5ng（濃度大于0.5ng/ul，DNA條帶清晰）。小于該總量或電泳檢測結果中無法識別到DNA條帶的樣品可以風險建庫。根據以往建庫結果判斷，如果樣品中確實有提取到的DNA，成功率很高。

綜合上述相關問題，可以發現在NGS測序環節中，DNA的質量會從多方面影響最終建庫成功率、下機數據的質量。這要求對不同物種、不同來源的樣品選擇最適合的方法，從而提取到質量最佳的DNA。同時派森諾提取方法也在不斷進行優化中，積累了非常多的項目經驗，在許多困難樣本中都能獲得質量合格滿足上機要求的樣品。

圖五 植物--農業作物、薔薇科、杜鵑科等

圖六 臨床樣本--癌組織、血液、細胞

圖七 動物組織--魚類、昆蟲

圖八 細菌/真菌/黏菌

圖九 宏基因組樣本--糞便、土壤、發酵物

另一方面，對于來源珍貴或提取極為困難的樣品，單純從提取方法上很難得到質量完全合格的DNA樣品。針對這部分樣品，需要根據實際DNA的狀態，優化建庫實驗方法，盡可能的將這部分樣品建庫成功，并得到高質量的測序數據。微量基因組就是為了滿足這類樣品不斷優化的一個建庫方案，這套方案已經在非常多的項目中成功建庫，詳細比對數據可以參考之前公眾號介紹（微量基因組建庫方案介紹）。