Nacia數字PCR在基因表達分析中的應用

華盛頓大學醫學院兒科和加利福尼亞大學圣地亞哥分校醫學院兒科的研究人員建立了一個穩定可靠的基于RNA磁珠提取和數字PCR的方法，可從糞便樣本中檢測與EE（熱帶腸病）關聯的人mRNA，靈敏度可達20拷貝GAPDH mRNA/200mg糞便樣本。

已有報道表明病人糞便中存在人mRNA，可作為反應病人消化道病理狀態的潛在標記物。然而以糞便為樣本檢測RNA必須克服兩大挑戰：一是糞便中含有大量PCR抑制劑，會嚴重影響PCR效率甚至PCR失敗；二是糞便樣本中的RNA絕大部分是微生物來源的，人mRNA含量極少。所以這項應用需要超靈敏的核酸分離檢測技術。

文中使用了數字PCR對大量凍存糞便樣本中多達70多個基因的表達量進行了分析，其中以GAPDH為內參，探針以VIC標記，各目的基因以FAM標記。所有70個樣本都已經雙塘吸收測試法檢測，同時隨機抽取樣本用數字PCR和RT-qPCR進行檢測，比較結果顯示，數字PCR相對于qPCR具有更高的靈敏度。基于數字PCR的糞便樣本RNA檢測手段可用篩選與消化道疾病相關的核酸標記。

大家知道定量PCR是通過實時熒光信號的分析處理進而獲得所謂Cq值，再根據Cq來對樣品定量。Cq值容易受PCR效率，特別是PCR抑制劑影響，所以qPCR在檢測靶標核酸豐度低及抑制成分高的樣本時，靈敏度和準確度會大打折扣。而數字PCR通過PCR終點判斷微滴陰陽性進而定量樣本的方式，受PCR效率和抑制物影響非常小，特別適合諸如：

1、以糞便、血液為樣本的病原微生物檢測、腫瘤標記物檢測；

2、以土壤、污水、淤泥、酒泥等為樣本的環境生物學研究和病原微生物監測；

3、經復雜工藝制作的含大量抑制物的食品材料中轉基因成分、動植物成分鑒定和含量分析，及致病微生物的檢測（CIQ/CDC）；

4、以骸骨、毛發、分泌物及排泄物，或者口腔脫離細胞、動物鱗片及皮膚，陳舊標本為樣本的法醫學、動物遺傳多樣性管理及野生動物保護等涉及核酸檢測分析的應用。

【Agapova S, Stephenson K, Manary M, Weisz A, Tarr PI, Mkakosya R, Maleta K, Shulman RJ, Manary M, Shaikn N. Detection of Low Concentration Host mRNA Transcripts in Malawian Children at Risk for Environmental Enteropathy. J Pediatr Gastroenterol Nutr.2012.】

近年來在小RNA的研究方面長非編碼RNA（long noncoding RNA，IncRNA）的研究成為熱點，IncRNA是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子的總稱。IncRNA的表達水平相對于編碼蛋白的基因一般比較低，重要的是很多這些IncRNA雖然不直接參與基因編碼和蛋白質合成，但是在基因轉錄后調控、剪切和修飾具有十分重要的功能，在很多生命活動中均起著舉足輕重的作用，和疾病的發生、發展、診斷和治療有著密切的關系，迅速成為當今分子生物學最熱門的前沿研究領域之一。另外，IncRNA的亞細胞位置上也呈多樣化，在細胞核、細胞質和細胞器均有分布，甚至某些IncRNA具有獨特的亞細胞位置，有可能是全新的亞細胞構成。

雖然研究甚少，但是人們逐漸認識到IncRNA具有重要的功能，因此，IncRNA的異常和疾病關系密切，將成為理解疾病、尋找疾病分子標記物、藥物靶點的新的研究方向。

最近美國科學家在NUCLEC ACID THERAPEUTICS 上發表了首篇將數字PCR應用于IncRNA研究的文獻。文章通過絕對定量的方式，對IncRNA分子進行直接定量，從而大致判斷其對基因表達的調控屬于順式還是反式作用；同時也對不同IncRNA以及管家基因在亞細胞水平上的表達做了分析。

【David W, Dodd, Keith T. Gagnon, and David R. Corey. Digital Quantitation of Potential Therapeutic Target RNAs. NUCLEIC ACID THERAPEUTICS, Volume 23,Number 2,2013.】
來自Fred Hutchinson癌癥研究中心等處的研究員在《Nature Method》發表文章證明了數字PCR技術能用于不同情況下，準確，可重復性的血漿和血清microRNA（miRNA）量化檢測，這將為miRNA及其它核酸用于循環生物標志物的檢測鋪墊了道路。

文章的第一作者，Fred Hutchinson癌癥研究中心人類生物學部Muneesh Tewari博士表示，“在循環系統miRNA診斷領域，數字PCR能幫助我們進行生物標記物研究，直接比較同一實驗室跨天多次實驗，甚至不同實驗室之間的檢測結果”

實時定量PCR（qPCR）已被廣泛用于血液樣品miRNA的分析測試中。但是研究人員發現，血清或血漿中的miRNA qPCR測量出現了極高的差異性，無法用作穩定的血液生物標志物的檢測標準，因此這一領域的研究人員一直在尋求一種能獲得更可靠結果的新方法。

數字PCR具有許多優于定量PCR的優點，比如無需標準曲線，以及不受不同樣品和試驗過程中PCR擴增效率變化的影響，就能獲得絕對定量。

為了評估每個工作流程的步驟，包括連續稀釋準備，反轉錄（RT）和PCR擴增，Tewari博士和他的團隊分別在三個獨立的工作日中，通過數字PCR嵌套分析對比定量PCR，對水和血漿中6中不同的合成miRNA各稀釋系列的cDNA進行分析，結果發現比較于qPCR，數字PCR在PCR特異性變化方面，具有更高的精確度（48-72%的更少變異系數）。

接下來，研究小組進行血清miRNA的qPCR和數字PCR并列比較檢測。他們收集了20例晚期前列腺癌患者，和20例年齡相匹配的男性對照血清樣品，分析其中的miR-141豐度，miR-141是一種已被證明的晚期前列腺癌的生物標志物。研究人員分別在不同的三天里準備了qPCR和數字PCR分析的不同稀釋濃度，并進行了檢測，結果發現數字PCR相比于qPCR，能提高7倍不同一天里實驗室的重復率，這在對照研究中也得到了證實：數字PCR的結果更為可信（p=0.0036 vs. p=0.1199）。

【Christopher M Hindson, John R Chevillet, Hilary A Briggs, Emily N Gallichotte, Ingrid K Ruf, Benjamin J Hindson, Robert L Vessella & Muneesh Tewari Absolut Quantification by droplet digital PCR versus Analog real-time PCR. Nature Methods | ADVANCE ONLINE PUBLICATION doi:10.1038/nmeth.2633.】

近期來自美國紐約西奈山醫學院的科學家接連刊發了數字PCR應用于胚胎干細胞基因表達研究的最新研究成果。胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESCs）簡稱ES細胞。ES細胞具有細胞全能性，在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內的各種組織的發育潛力，即ES細胞具有發育成完整動物體的能力，可以為細胞的遺傳操作和細胞分化研究提供豐富的實驗材料。

研究人員發現，MicroRNA-137（miR-137）在ES細胞分化為神經細胞的過程中發揮了重要的作用。科學家使用數字PCR和qPCR同時驗證了在不同細胞周期條件下miR-137的表達水平，發現miR-137在細胞M期（metaphase）表達顯著上調。聯合其他實驗證據可以表明，miR-137可以通過抑制下游轉錄調控因子的表達進而調節ES細胞的增殖和分化。

【Ke Jiang, Chunyan Ren, Venugopalan D. Nair MicroRNA-137 Represses Klf4 and Tbx3 During Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cell Research (2013) 11,1299-1313.】