Nature子刊：雙功能CRISPRCas9，可同步實現基因編輯和調控

　　哈佛醫學院著名遺傳學家George Church教授是基因編輯技術的鼻祖之一：2年前張鋒使用CRISPR技術完成了多重基因組編輯，Church則使用CRISPR技術完成了RNA介導的人類基因組編輯。

　　自此之后，CRISPR/Cas9技術持續火爆，方便快捷的方式迅速風靡科研界，不論是醫學研究，農學研究，微生物研究，都對其投入巨大精力。迄今為止，從PubMed數據庫中查詢，關于Cas9的文章共有951篇，其中最新的一篇是9月7日的Nature子刊——Nature Methods報道了哈佛大學和麻省理工的研究團隊開發了雙重功能的CRISPR-Cas9系統，能夠同時實現基因組編輯和基因調控。

　　過去：基因編輯和基因調控需要用到不同的Cas9蛋白

　　眾所周知，Cas9是蛋白RNA復合物，其中的小型引導RNA識別特定DNA序列的能力。不論是基因編輯還是基因調控，CRISPR-Cas9的第一步是相同的：引導RNA通過序列互補原則將Cas9帶到基因組特定位點，使其與目的基因結合。不過到目前為止，基因編輯和基因調控需要用到不同的Cas9蛋白。基因編輯依賴Cas9的DNA剪切活性；而基因調控需要抑制其剪切活性，只保留Cas9結合靶標基因的能力。在過去，基因調控所用的Cas9變體通常與調控基因表達的蛋白融合在一起。

　　雙重功能的CRISPR-Cas9系統，可同步實現基因編輯和調控

　　哈佛大學的George Church教授和麻省理工的Ron Weiss教授共同領銜的研究團隊開發了一個新策略，成功用一種Cas9同時完成基因編輯和基因調控兩項任務。gRNA又稱引導RNA，真核生物中參與RNA編輯的具有與mRNA互補序列的RNA。引導RNA為模板的插入編輯，即RNA編輯所需要的信息或者來自向導RNA，或者來自被編輯的RNA自身。

　　引導RNA的編輯過程

　　CRISPR/Cas9的成功與否的關鍵問題在于gRNA的設計，gRNA和非目標區域過多的非特異性結果，脫靶效率較高，特別是靠近PAM的8-10bp不能和非目的區有高同源性。目前為了提供基因組操作的準確性，對Cas9核酸酶進行了突變，突變后的Cas9n 只能切割DNA雙鏈中的一條鏈，通過兩個gRNA引導Cas9對DNA切割：gRNA-I首先以其5’端與前體RNA互補配對，從3’向5’方向插入UMP；gRNA-II繼續完成編輯的全過程。該方法可以顯著提高基因組編輯的特異性，降低脫靶效率。

　　選擇適合的引導RNA的長度是關鍵

　　文章的第一作者之一Alejandro Chavez博士表示：在決定Cas9結合DNA之后是否進行切割過程中，引導RNA的長度起到了關鍵性作用；過度截短引導RNA使Cas9不能切割其基因組靶點；不過截短引導RNA并不影響Cas9與靶基因的結合。人們可以在此基礎上，用Cas9把基因調控蛋白送到特定的基因上，即在此基礎上改造的引導RNA和化膿性鏈球菌的Cas9蛋白，在切割特定基因的同時也可調控其他基因的表達。

　　雙功能CRISPR-Cas9發現的實際應用意義

　　Church教授表示，以后人類可以根據引導RNA的最適合長度原則，用一種蛋白獲得對基因序列和基因表達的直接控制，使得幾乎所有DNA都能轉變為調控序列，從而進一步操縱細胞。其實際應用意義有2方面：一是揭示重要過程背后的復雜互作（比如癌癥耐藥性和干細胞分化）；二是設計更高級的人工基因回路。

　　文章的一位共同作者Marcelle Tuttle博士則表示，雙功能CRISPR-Cas9可以提升破解致病基因之間的復雜關系的能力；還可以用于工業領域，促進基因工程菌株（E. coli等）大規模生產化合物和燃料，同時保護這些菌株不被其他病原體感染。

　　Wyss研究所的Donald Ingber博士說認為，此項研究顯著提高了CRISPR-Cas9的控制水平，進一步拓展了這一系統的應用范圍。