Nature子刊：慢性胰腺炎動物模型是如何開發的？

　　波士頓大學口腔醫學院的Andrea Geisz和Miklós Sahin-Tóth開發出一種T7D23A基因敲入小鼠，以填補此領域的空白。這種小鼠攜帶陽離子胰蛋白酶原（T7亞型）的雜合p.D23A突變，為胰腺炎的研究和治療提供了出色的模型。

　　胰腺炎是因為胰蛋白酶的自身消化作用而引起的疾病，包括急性胰腺炎、復發性急性胰腺炎和慢性胰腺炎。這些疾病常常引起腹痛、惡心、嘔吐、發熱等癥狀，但并沒有特異性療法。

　　以往的研究表明，編碼消化蛋白酶或其抑制劑的基因若發生突變，則往往會促進急性胰腺炎的發生，并逐漸發展成慢性胰腺炎。例如，PRSS1（陽離子胰蛋白酶原）、CTRC（胰凝乳蛋白酶C）以及SPINK1（Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑1）的致病突變通過刺激自發激活或干擾保護機制，從而促進胰蛋白酶原轉化成有害的胰蛋白酶。

　　不過，基因突變引起的胰腺內胰蛋白酶原自發激活具有直接致病作用，這雖然獲得了大量的遺傳和生化證據支持，但目前還缺乏適當動物模型的確認。更重要的是，動物模型的缺乏還阻礙了胰蛋白酶抑制劑的臨床前試驗。

　　為此，波士頓大學口腔醫學院（Henry M. Goldman School of Dental Medicine）的Andrea Geisz和Miklós Sahin-Tóth開發出一種T7D23A基因敲入小鼠，以填補此領域的空白。這種小鼠攜帶陽離子胰蛋白酶原（T7亞型）的雜合p.D23A突變，為胰腺炎的研究和治療提供了出色的模型。這項成果近日發表在《Nature Communications》上。

　　T7D23A基因敲入小鼠的開發

　　小鼠基因組包含20個胰蛋白酶原基因。之前的研究表明，只有四種胰蛋白酶原高水平表達，它們分別是：T7、T8、T9和T209亞型。其中，T7亞型占胰蛋白酶原總量的40-50%，并且與其他亞型相比自發激活更快，產生的胰蛋白酶水平也更高。

　　為了產生自發激活增加的T7突變體，研究人員在激活肽中引入了Ala突變，以取代Asp23（p.D23A）。為了在體外測試T7 p.D23A突變體的激活特性，他們純化了重組野生型和突變型T7胰蛋白酶原，并測定了自發激活。與野生型相比，p.D23A突變體的自發激活顯著增加了50倍，同時，其他胰蛋白酶激活和降解途徑不受影響。

　　之后，研究人員委托賽業生物（Cyagen）制備了T7D23A基因敲入小鼠，具體是通過C57BL/6胚胎干細胞中的同源重組將p.D23A突變引入小鼠基因組（圖1）。DNA測序表明，這些雜合小鼠在突變位點顯示出兩個高度相當的峰，表明野生型和突變型等位基因的表達水平相當。新的T7D23A品系未出現明顯的表型改變，并且正常繁殖。

圖1. p.D23A突變對胰蛋白酶原T7亞型的影響。

　　T7D23A小鼠出現自發的急性和慢性胰腺炎

　　研究人員對T7D23A小鼠的胰腺形態進行觀察，發現2-3周時是正常的，但4-5周時變化較大，而2個月后胰腺明顯變小。組織學檢測發現，T7D23A小鼠從第3周開始出現典型的急性胰腺炎，在4-5周出現得更加頻繁（~40%）。水腫破壞了緊密排列的組織結構，大量炎性細胞浸潤，且小葉出現中心局部壞死（圖2）。

　　在4-5周時，研究人員發現超過一半的小鼠表現出明顯的疾病進展。它們的胰腺切片顯示出廣泛的再生指征，包括假管復合物出現、胰管擴張和彌漫性間質纖維化，這些都是早期慢性胰腺炎的特征。從2個月開始并持續到6至12個月，脂肪開始在組織學圖像中占據主導地位，而炎性細胞和假管復合物的數量開始減少。在擴張胰管的周圍纖維化更普遍，有時還充滿嗜酸性物質，這些是晚期慢性胰腺炎的特征。

圖2. T7D23A小鼠的胰腺組織學。

　　之后，研究人員將T7D23A小鼠的胰腺重量與C57BL/6N對照小鼠進行比較，發現約40%的小鼠在4-5周齡表現出明顯增加。這種增加與組織切片上觀察到的水腫性急性胰腺炎一致。大約50%的小鼠在4-5周齡時胰腺重量明顯減輕，表明早期慢性胰腺炎的出現。所有T7D23A小鼠在2月、6月和12月齡時顯示出與晚期慢性胰腺炎相關的胰腺萎縮，與對照小鼠相比胰腺重量減輕約70%。

　　T7D23A小鼠的酶活檢測

　　淀粉酶是診斷急性胰腺炎最常用的指標。因此，研究人員也測定了各個年齡的T7D23A小鼠血漿中的淀粉酶活性。在4-5周時，他們在約40%的小鼠中觀察到淀粉酶值偏高，這與之前的結果一致。不過，并非所有小鼠都能捕獲到急性胰腺炎的指標，這可能與采樣時間和發病年齡有關，也可能是小鼠在沒有急性發作的情況下患上慢性胰腺炎。

　　接著，他們以3周齡（無病理變化）、4周齡（急性或早期慢性胰腺炎）和2月齡（晚期慢性胰腺炎）T7D23A小鼠為對象，測定了新鮮制備的胰腺勻漿液中的胰蛋白酶活性。與相同年齡的對照小鼠相比，3周時未檢測到胰蛋白酶活性的升高，但在4周時檢測到高值。盡管功能性腺泡細胞減少，但在2個月時仍觀察到酶活的升高，表明胰腺內胰蛋白酶的激活在整個疾病過程中持續存在。這些結果支持了，胰蛋白酶原的自發激活可引起急性胰腺炎發作，且隨后發展成慢性胰腺炎。

　　為了排除與胰蛋白酶原自發激活無關的疾病機制，研究人員還制備了p.D23A、K24G雙突變的小鼠品系，除了帶有雜合的T7D23A等位基因，胰蛋白酶原激活位點Lys24也經過突變。這種小鼠在5.5個月時沒有出現自發的胰腺病理變化。這個結果提供了令人信服的證據，說明胰蛋白酶原錯誤折疊等機制并不引起T7D23A小鼠的表型。

　　T7D23A小鼠與人類胰腺炎的特征比較

　　研究人員認為，這種新模型概括了人類胰腺炎的臨床疾病特點，它總是先發展為急性胰腺炎，然后再發展為不可逆的慢性胰腺炎。不過，他們沒有觀察到人類經常出現的急性病情反復發作。這種差異可能是由此處所用的胰蛋白酶原突變造成的。

　　研究人員認為，他們展示了第一個慢性胰腺炎的臨床前小鼠模型，該疾病是由胰腺內胰蛋白酶原自發激活的增加所驅動的。這個模型概括了人類慢性胰腺炎的顯著特征。值得一提的是，盡管T7D23A小鼠出現明顯的病理變化，但它們能夠正常繁殖并發育到成年期，這是臨床前應用的先決條件。

　　“在概念層面，這個模型提供了直接的體內證據，表明胰蛋白酶原的自發激活可驅動慢性胰腺炎的發作和發展，且治療方法應針對胰腺內的胰蛋白酶，”研究人員總結道。