Nature子刊：來自人類腸道細菌的小型化Cas9，可用于高效精準的基因組編輯

　　CRISPR基因編輯技術極大地加速了遺傳疾病治療方法的開發。然而，臨床的進一步發展在很大程度上取決于開發多樣化工具以應對基因組編輯的挑戰。其中，最關鍵的一個方面是遞送，因為Cas核酸酶及其衍生的融合產物（包括堿基編輯器、先導編輯器）的尺寸較大。

　　腺相關病毒（AAV）是最高效和最廣泛使用的體內遞送載體，但其載體容納量僅為4.7 kb，導致其很難與CRISPR系統兼容，最常用的來自化膿性鏈球菌的SpCas9及其sgRNA和必要的調控區域就無法被單個AAV所裝載。一些小型化Cas9核酸酶，例如來自金黃色葡萄球菌的SaCas9和腦膜炎奈瑟菌的Nme2Cas9可以被單個AAV遞送，但它們基因編輯效率低于SpCas9。總之，在原核生物（細菌、古菌）中廣泛存在的CRISPR-Cas系統的多樣性尚未被充分開發。

　　通過宏基因組測序和宏基因組組裝基因組（MAG）重建，已經鑒定了大量的未表征的原核生物物種，其中許多編碼系統發育多樣性的Cas9同源物。大多數質量控制的MAG具有足夠高的質量，能夠對整個Cas9基因座進行全序列表征，而這種揭示出的多樣性有可能為發現具有理想特性的核酸酶提供可能性，以應對治療應用中的復雜性。

　　近日，意大利特倫托大學的研究人員在 Nature Communications 期刊發表了題為：CoCas9 is a compact nuclease from the human microbiome for efficient and precise genome editing 的研究論文。

　　該研究從人類腸道微生物組中發現了一種來自科林斯屬（Collinsella）腸道細菌的Cas9核酸酶——CoCas9，其具有高效和精準基因編輯特性，脫靶性遠低于spCas9。更重要的是，CoCas9尺寸較小，僅1004個氨基酸，可與其sgRNA一起包裝在AAV載體中，用于體內遞送。此外，CoCas9還可與脫氨酶融合，用于堿基編輯。

　　該研究在人類原代細胞和人源化小鼠模型中進一步驗證了CoCas9的高效和精準基因編輯特性，展示了CoCas9的臨床開發潛力。

　　在這項研究中，研究團隊在一個大型數據庫中搜索了未被描述的小型Cas9變體，該數據庫由>154000個微生物基因組組成，這些基因組由>9400個人類相關宏基因組重建而來，其中包括超過3000種以前未被表征的細菌物種。

　　該研究從中發現了大量II型CRISPR-Cas基因座（n=17173），其中，一種來自未被表征的科林斯屬（Collinsella）腸道細菌的Cas9核酸酶——CoCas9，其具有高效和精準基因編輯特性，脫靶性遠低于spCas9。更重要的是，CoCas9尺寸較小，僅1004個氨基酸，可與其sgRNA一起包裝在AAV載體中，用于體內遞送。此外，CoCas9還可與脫氨酶融合，用于堿基編輯。

　　為了評估CoCas9的治療應用潛力，研究團隊在人原代細胞中測試了其編輯活性，用慢病毒載體向人類造血干/祖細胞（HSPC）、人支氣管上皮細胞（HBE）和人皮膚成纖維細胞（HSF）遞送CoCas9系統，并在嘌呤霉素抗性篩選后，在6個位點均顯示出高基因編輯活性。

　　接下來，研究團隊評估了CoCas9在小鼠模型中的表現。在表達人RHO基因（hRHO）的人源化小鼠模型中，研究團隊向5周齡的小鼠視網膜下注射AAV8共遞送的CoCas9及其sgRNA，以靶向編輯hRHO基因，該基因突變會導致常染色體顯性遺傳性視網膜色素變性。結果顯示，注射4周后，在hRHO目標處實現了最高達到35.6%的編輯效率，在7只視網膜中的平均編輯效率為10.5%。

　　該研究發現了一系列之前未被表征的Cas9核酸酶，尤其是CoCas9，豐富了基因組編輯工具箱。在人類原代細胞和人源化小鼠模型中實驗表明，CoCas9具有臨床開發潛力。