NatureMethods十大技術：光遺傳學的利與弊

　　Nature Methods雜志在十周年之際推出了紀念特刊，點評了在過去十年中對生物學研究影響最深的十大技術，其中就包括光遺傳學技術。

　　我們可以毫不夸張地說，光遺傳學技術給神經學帶來了一場革命。現在，這一技術已經迅速成為了許多實驗室里的標準工具。盡管光遺傳學還不是一個家喻戶曉的名詞，不過它已經進入了科研領域的主流。越來越多的人相信，光遺傳學技術不僅可以闡明疾病機理，還能夠治療多種人類疾病（比如與視網膜有關的疾病）。

　　隨著光遺傳學技術的廣泛應用，人們開始認識到這一技術中的種種局限，而這又進一步刺激了光遺傳學的發展。Nature Methods以“Optogenetics: the age of light”為題，回顧了光遺傳學近期取得的新成果，探討了這一技術中存在的一些問題。文章指出，要完全發揮光遺傳學的潛力，人們還需要更好的探針和光遞送策略，對結果進行更謹慎的解讀。

　　光遺傳學技術好在哪兒

　　用光讀取和控制神經活性的好處很明顯，這種技術是非侵入性的，能在精確的時空點上進行靶標，可以同時采用多種波長和位點，能報告特定分子的存在或活性。光遺傳學這個名詞，是遺傳學靶標和光學檢測的結合體。在信號讀取方面，人們開發了高度敏感的探針，檢測突觸的釋放、細胞內鈣離子和膜電壓。在神經元操縱方面，人們鑒定和優化了一系列激活和失活神經元的蛋白。

　　光遺傳學技術已經滲透到了神經學的每一個角落，研究者們不僅用它來研究大腦的基礎功能，還在動物模型中探索疾病的發病機制。光遺傳學的激活子和抑制子可以在同一個細胞內表達，這對于因果關系的建立特別有幫助。光遺傳學抑制子的開發是近期最重要的進展之一。光遺傳學技術能夠將不同水平的神經系統功能關聯起來，為行為和認知提供直觀的解釋。

　　在光遺傳學領域，開發新探針是至關重要的。人們對光敏蛋白Channelrhodopsin及其突變體進行不斷改造，開發了更利于雙光子激發的C1V1、能在大腦深處或透過頭蓋骨激活的ReaChR。最近，研究者們還在高分辨率晶體結構的基礎上，改造出了光遺傳學抑制子。此外，人們也從自然界鑒定了一些抑制性的視蛋白，包括現在廣泛使用的Arch15和最近發現的Jaws。在信號讀取方面，出現了新一代的鈣離子感應器（比如GCaMP6和Twitch）和電壓感應器（QuasAr家族）。

　　光遺傳學技術有什么問題

　　一些批評者認為，光遺傳學激活子的標準用法存在瑕疵。首先，這樣的刺激水平可能使神經元應答超出生理范圍，而這一點又很難加以評估。在這種情況下，神經回路會出現不自然的變化，最后導致不正確的生理學結論。這個問題不僅限于激活子，抑制子也可能超出正常的作用范圍。其次，光敏蛋白的表達和光照在神經元群體中并不均勻，結果是光遺傳學操縱的量級和范圍會出現異質性。另外，大范圍光刺激同時作用在神經元群體上，可能使回路出現非生理性的活動模式。最后，傳統光遺傳學技術靶標特定遺傳學背景的神經元群體，不能再選擇性激活其中的亞群。現在，科學家們已經開始著手解決這些問題。

　　在解讀光遺傳學實驗的結果時，刺激的位點也會產生重要的影響。刺激表達光遺傳學探針的軸突是一個常用的策略，不過直接用光刺激軸突boutons，會引起非生理性的神經遞質釋放，容易使人過高估計突觸連接的影響。此外，直接對軸突進行光遺傳學刺激，還可能引起逆行激活（antidromic activation），這個問題是很難控制的。

　　光遺傳學技術的難點在哪里

　　解讀光遺傳學操縱的結果是比較困難的。此外，由于光遺傳學探針的表達工具有限，目前的探針使用可能對目標產生干擾。這個問題對于光遺傳學的臨床應用尤為重要。對于哺乳動物的大腦研究而言，病毒還是光遺傳學中的主要表達工具。然而，這些病毒的特異性、長期使用的毒性以及表達的穩定性，都存在著不小的挑戰。目前已發表的研究大多沒有很好的解決這些問題（只有少數例外）。舉例來說，有研究顯示不論是用病毒還是子宮內電擊轉染，長期高水平表達ChR2都會造成軸突形態異常。而這只是冰山一角。

　　這些研究讓人們開始擔心，光基因（optogene）表達對神經回路的干擾。為此，我們需要進行嚴格的解剖學和生理學控制。在光遺傳學用于治療人類疾病之前，我們必須開發更好的病毒體系，仔細評估病毒遞送系統的長期安全性和有效性。

　　光遺傳學技術的下一個十年

　　盡管光遺傳學很給力，但它也不是萬能的。跟所有新方法一樣，它的局限性正逐漸為人們所知。我們在設計、實施和解讀光遺傳學實驗時必須將這些信息納入考慮。上文所提到的問題中，許多都能在“all-optical”方案中得到解決。這種方案是指，將激活子和感應器的表達結合起來，確保讀取和控制的是同樣的神經元。這是一個很大的挑戰，首先高速光刺激和讀取受到了硬件上的限制，另外現有探針的靈敏度和時間分辨率還不夠。

　　然而，“all-optical”系統還不足以模擬體內的神經元活動模式。我們還需要在活體內對單個神經元進行研究。在活體內靶標單個神經元，需要非常精確的光調節和探針表達，以便在指定神經元生成可靠信號。在光學方法較難觸及的大腦深處，這樣的實驗尤為困難。

　　光遺傳學與神經學的聯姻正在慢慢走出蜜月期。光遺傳學研究中出現的技術和數據解讀問題，刺激了新一輪的技術進步。我們可以滿懷信心地說，下一個十年光遺傳學將迎來更光明的未來。