P1噬菌體克隆在大腸桿菌宿主間的轉移

限制性內切核酸酶 閉環重組 P1 DNA 電轉感受態大腸桿菌細胞

瓊脂糖凝膠 LB 瓊脂平板 SOC 培養基 電穿孔儀

一、材料

1. 酶與緩沖液

限制性內切核酸酶

2. 凝膠

瓊脂糖凝膠

3. 培養基

含 25 μg/ml 卡那霉素的 LB 瓊脂平板

SOC 培養基

含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培養基

4. 專用設備

電穿孔儀

5. 載體和菌株

閉環重組 P1 DNA

冷凍保存的電轉感受態大腸桿菌細胞（如 DH10B )

二、方法

1. 用無菌水將 2~3 μg P1 質粒 DNA 稀釋至 60 ng/μl。設一不含 P1 DNA 的對照樣品 (無菌水)，在電穿孔時作為平行對照。.

2. 將電轉感受態細胞置于冰上融化。預冷 0.1 cm 電穿孔杯。

3. 將 20 μl 細胞與 1 μl P1 DNA 在預冷的電穿孔杯中混合。

4. 將電穿孔儀設為 1.8 kV, 200 Ω，25 μF。

5. 電擊細胞，最佳時間常數通常約為 5 ms。

6. 立即向細胞懸液中加入 0.5 ml 預熱至 37℃ 的 SOC 培養基。將懸液轉移至一培養管中，37℃ 中度振蕩培養 1 h。

7. 將 100 μl 的細胞懸液涂布于含 25 μg/ml 卡那霉素的 LB 平板上，37℃ 溫育過夜。

8. 將 10~12 個菌落分別置于 11 ml 含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 培養液中。37℃ 劇烈振蕩，培養過夜。

9. 制備 P1 DNA。

10. 用不同限制性內切核酸酶進行酶切，經瓊脂糖凝膠電泳比較新提取的 DNA 與原始重組子 DNA 的酶切圖譜。