PCR的作用原理和過程

技術原理：DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑.雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶與啟動子的參與下,根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝.在 聚合酶鏈式反應實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低后又可以復性成為雙鏈.因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,并設計引物做啟動子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制.
　　但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術的應用和發展.發現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環加酶,使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術得以大量應用,并逐步應用于臨床.
工作原理：類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物.PCR由變性--退火(復性）--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時 聚合酶鏈式反應間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至40~60℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,于72℃左右,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板.每完成一個循環需2～4分鐘,3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍.
PCR反應的基本過程標準的PCR過程分為三步
　　1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,
　　氫鍵斷裂,形成單鏈DNA
　　2.退火（復性）（25℃-65℃）：系統溫度降低,引物與
　　DNA模板結合,形成局部雙鏈.
　　3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右zui佳的活
　　性）的作用下,以dNTP為原料,從引物的5′端→3′ 端延
　　伸,合成與模板互補的DNA鏈.
　　每一循環經過變性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍.
　　現在有些PCR因為擴增區很短,即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的時間內復制完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,以減少一次升降溫過程,提高了反應速度.