PCR擴增的歷史及發展

 讓我們回顧一下過去，看看35年前，當GEN開始報道這種相對新的基因工程和分子生物學技術的情況。在當時，GEN是最早知道這種在實驗室合成和擴增DNA新方法的公司之一。我們在這里，將通過回顧PCR的引人入勝的歷史，來展望未來其在分子診斷領域的成型和發展方向。

熱情似火

    生物科學在空間上很少進步的，他們主要依靠過去的發現來直接或者間接促進我們的了解。在分子生物學領域中，科學家們的貢獻使得在過去二十多年中，PCR的功能是分散的。

    PCR是始于H. Gobind Khorana對遺傳密碼理解的進步，這導致了DNA寡鏈核苷酸合成的使用，并在1971年Kjell Kleepe通過對于DNA復制系統的雙引物概念得到了進一步的延伸，一直到Fredrick Sanger的測序方法，這種方法為其贏得了1980年的諾貝爾獎，Fredrick Sanger的方法中，其使用了DNA寡聚引物，核苷酸前體和DNA合成酶。

    這些事前的發現為PCR技術的誕生奠定了基礎，然而，如果在回顧PCR技術的時候，不討論整個反應鏈的酶-DNA聚合酶，則是一個巨大的錯誤。1956年，諾貝爾獎得主Arthur Kornberg和他的同事們在大腸桿菌中發現了DNA聚合酶（Pol I）。此外，研究人員描述了這種聚合酶復制DNA模板鏈堿基序列的過程。然而，科學家們花費了20年，才發現了另一種足夠穩定的，可以用于任何實驗目的的實驗室使用的聚合酶。

    在1976年，辛辛那提大學的一個研究小組發現了一種聚合酶，其是從極端嗜熱細菌中分離出來的，這種水生棲熱菌主要生活在溫泉和熱液噴口處。事實上，這種聚合酶能夠忍受通常的蛋白質變性的溫度，并且能夠在75-80°C附近發揮功能，這奠定了PCR技術的發展。

    到1983年，所有的分子材料都經準備就緒，就等待適當的組裝順序。當時，諾貝爾獎得主Kary Mullis正在為Cetus Corporation工作，其試圖完美的合成寡核苷酸。他偶然的發現了使用多個復制循環和兩個引物系統的方法擴增DNA片段的方法，這是在Sanger測序反應的基礎上進行了必需的修改和擴大。Mullis發現反應中每一步的溫度（融化、退火和擴展）都需要精心的手工控制。此外，他意識到，因為反應使用費耐熱性的DNA聚合酶，在每一個成功的循環之后，都需要加入新鮮的酶。

    Mullis艱苦的工作和堅持終于有了回報，通過兩個相反的核苷酸引物分子，某個特定的DNA片段的擴增反應成功的實現了。兩年后，Cetus團隊在美國人類遺傳學協會年會上展示了他們的作品，并且同一年，在《Science》上投稿的文章第一次提到了這種技術；不過，那篇文章并沒有詳細的說明新開發的PCR技術的具體細節-因此這篇文章被大約15個雜志拒稿，知道1987年才得以發表。

    雖然科學家們吸收新方法的速度有點慢，但是Cetus的研究人員一直開發改進原有的方法。1986年，科學家們使用耐高溫的Taq DNA聚合酶代替了原有的酶，把需要加酶的步驟去除，大大減少了錯誤率，提高了靈敏度。一年后，PerkinElmer推出了他們的熱循環儀，這使得科學家們在PCR反應中可以調節加熱和冷卻，并獲得了更高的效率。

    在Taq酶和熱循環儀推出后不久，PCR反應在研究實驗室中獲得的指數爆炸級別的發展，其不作用不僅僅限于分子生物學，它還使分子診斷發生了革命，并且這個革命現在還在繼續，并沒有顯示出放緩的跡象。

分子工廠

    在PCR首次出現之后的很多年，很多重大技術的進步已經廣泛的改善了PCR技術。例如，1991年，從嗜熱菌激烈火球菌獲得的一種新的DNA聚合酶，即Pfu，也被引進了PCR，這種酶相比較于Taq，具有高保真的特性。不同于Taq酶，Pfu建立了3’到5’核酸外切酶活性，這種活性可以使得酶能夠校正錯誤結合的核苷酸-并能夠增加堿基的特異性，但是相比較于Taq，有一個速度的減緩。

    1995年，PCR使用又有了兩步進步。第一，即稱為抗體“熱啟動”的PCR，其利用免疫球蛋白分子定向DNA聚合酶并抑制其活性，直到第一個95°C的融化階段，這個溫度會造成抗體變性并使聚合酶具有活性。雖然這個過程能夠有效地提高PCR反應的特異性，但是許多研究人員發現，這項技術即耗費時間，而且會經常造成樣本的交叉污染。

    第二個引入的創新是針對分子生物學和PCR方法的。即實時PCR，或者定量PCR（qPCR），其可以使研究人員定量創建用于PCR擴增的DNA模板，即通過使用逆轉錄酶轉錄RNA，并結合特定的熒光報告染料來實現。這項技術因為其檢測基因表達極其準確，因此被研究人員廣泛的使用。在過的20年里，許多公司花費了大量的研發資金來構建一個更準確，更高通量和簡單的qPCR機器來滿足研究需求。

    隨著新一代測序技術的崛起-這項技術的崛起獲得了越來越多研究人員的關注-PCR機器和方法也需要不斷現代化以保持同步。在幾乎所有的下一代測序反應中出現的PCR仍是關鍵，但是傳統的技術并不需要那么的精確。

    數字PCR（dPCR）相比較于常規方法則更為細化，第一個真正的商業系統出現在2006年左右。dPCR可以直接量化和克隆擴增DNA或者RNA。

    設備內一個分區進行一個樣本的反應。然而，樣本被分割到了大量的分區中。此外，在每個分區中進行的反應使得核酸的檢測更為可靠。研究人員經常使用這種方法研究基因序列的變化，如拷貝數變異（CNV），點突變，罕見序列缺失以及microRNA分析，并且可以作為下一代測序技術的樣品放大技術。

PCR的未來：更好，更快，更強

    未來實驗室的設置不以某種方式使用PCR時不可能的，尤其是由于下一代測序技術嚴重依賴于PCR樣品的準確性，因此其至少要使用一個方法來見大的放大我們感興趣的DNA片段。

    然而至少已經有一種下一代測序技術可以在沒有擴增步驟的前提下，識別天然的DNA序列。雖然這種技術在初步實驗中表現良好，但是其還在幼年期。這種技術可能會在研究人員發規模采用之前，還需要幾年的時間來進行額外的開發完善。即便如此，PCR技術在日常實驗室實驗中已經變得如此根深蒂固，試圖淘汰PCR技術就像要求生物分子雪茄放棄他們的吸量管或者限制性內切酶一樣。

    大多數PCR設備制造商試圖尋求不同的方法來提供其熱循環的速度和靈敏度，而聲學家則希望尋找更好地能夠具有更高保真度的DNA聚合酶分子。無論取得什么樣的進展，無論他們如何引領生命科學領域，你可以指望，我們能夠為我們的讀者繼續提供詳細的信息至少35年。