讓基因組測序繞過PCR擴增

　　在基因組測序中，PCR擴增似乎是繞不過去的一步。然而，PCR也帶來一些問題，包括不均勻擴增，導致某些序列的比例過高。對目前的新一代測序（NGS）平臺而言，測序某些堿基組成上存在嚴重偏向的基因組區域仍是一大挑戰。在GEN雜志上，Patricia Fitzpatrick Dimond博士介紹了PCR-Free的基因組測序。

　　文庫制備的變革

　　2009年，Sanger研究院的Iwanka Kozarewa博士及其同事介紹了一種無需擴增的Illumina文庫制備方法（Nature Methods 2009；6:291–295）。他們表示，GC偏向的基因組的定位和組裝有所改善。這種方法采用簇擴增步驟來富集完全連接的模板鏈，降低了重復序列的發生率，改善了序列定位和SNP檢出。

　　這種方法的核心是采用no-PCR接頭，它們包含額外的序列，讓模板能夠與流動槽表面直接雜交，這樣就不再需要PCR步驟。作者表示，通過此方法產生的DNA模板量低于PCR方法，但定量研究表明，從5 μg起始DNA中獲得的文庫足夠400個GA通道的測序，這滿足了大多數的實驗需求。此外，由于省去了PCR步驟，這種方法比標準的文庫制備更快。

　　Illumina的產品經理Rooz Golshani表示：“我們的PCR-free產品，TruSeq? DNA PCR-Free Library Preparation Kit，是金標準，也是產生最完整基因組的最佳方案。”Golshani博士指出，研究人員在需要避免PCR相關的偏向時，往往采用此試劑盒來制備文庫。

　　2015年，J. Craig Venter研究所的Marcus B. Jones及其同事指出，隨著全基因組測序被廣泛用于人類微生物組研究，研究結果往往被證明是沖突或不確定的（Proc Natl Acad Sci USA 2015；10；112:14024-9）。

　　研究人員開展定量和定性分析來比較WGS宏基因組數據。他們采用Illumina Nextera XT和TruSeq DNA PCR-Free以及KAPA Biosystems的Hyper Prep PCR和PCR-Free系統。研究表明，這四種不同的NGS文庫制備導致分類出現明顯差異。根據分析的結果，他們建議從事微生物組研究的研究人員采用PCR-free的方法來減少PCR偏向，從而獲得更準確的分類信息。

　　納米孔測序

　　這些PCR-free的技術都是針對Illumina的測序儀開發的，不過，一種顛覆性的測序技術已經徹底改變DNA測序的方式，這就是納米孔測序。

　　Oxford Nanopore Technologies開發的手機大小的MinION測序儀有望最終拋棄PCR。它讀取長的DNA片段，不過目前仍需要文庫制備。這種方法在分辨重復序列或單體型上具有優勢，因為單個測序片段就能跨越含糊不清的區域。未來，這種設備有望用于實時醫療診斷和法醫檢驗。

　　不過，英國研究人員認為，在廣泛采用MinION之前，需要評估其通量和準確性（Biomol Detect Quantif 2015；3: 1–8）。他們利用MinION對三個細菌基因組進行重測序，這些有著不同的核苷酸組成。研究人員發現，MinION堿基檢出后的錯誤率為38.2%。讀長平均值和中值分別為2 kb和1 kb，而最長的序列達到98 kb。作者認為，盡管錯誤率限制了MinION的競爭能力，但是與Illumina MiSeq的數據相結合，MinION的序列數據可增強de novo組裝。

　　隨著MinION的試用報告不斷出爐，人們發現，MinION本身也能做很多事情。它能可靠地測序小型基因組，如細菌和酵母。它也能區分親緣關系很近的細菌和病毒，讀取人類基因組中的復雜區域，并區分一對染色體上的兩個基因版本。此外，傳染病檢測也有望成為這種手持式測序儀的一大應用。