RNA干擾（RNAinterference，RNAi）基礎知識(2)

1RNA i的發現
RNA i是在研究秀麗新小桿線蟲（C. elegans）反義RNA （antisenseRNA ）的過程中發現的，由dsRNA 介導的同源RNA 降解過程。1995年，Guo等發現注射正義RNA （senseRNA ）和反義RNA 均能有效并特異性地抑制秀麗新小桿線蟲par-1基因的表達，該結果不能使用反義RNA 技術的理論做出合理解釋。直到1998年，Fire等證實Guo等發現的正義RNA 抑制同源基因表達的現象是由于體外轉錄制備的RNA 中污染了微量dsRNA 而引發，并將這一現象命名為RNA i。
此后dsRNA 介導的RNA i現象陸續發現于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等多種真核生物中，并逐漸證實植物中的轉錄后基因沉默（posttranional gene silencing，PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA 介導的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）現象均屬于RNA i在不同物種的表現形式。

1999年，Hamilton等首次在PTGS植株中發現了長度為25nt的RNA 中間產物。2000年，Zamore和Hammond等使用體外培養的果蠅細胞進行研究發現，外源性dsRNA 通過耗能過程降解成21-23nt的小干擾RNA （small interferingRNA ，siRNA ）引發RNA i。
2000年，Wianny和Svoboda等分別證實在小鼠胚胎細胞和卵母細胞中dsRNA 能引發RNA i效應。2001年，Elbashir等證實21nt的siRNA 可在避免激活dsRNA 依賴的蛋白激酶(dsRNA -dependent protein kinase，PKR)和2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'-oligoadenylate synthetase，2',5'-OAS)信號轉導途徑的同時，有效抑制人胚腎293細胞、Hela細胞等哺乳動物細胞中目的基因的表達。
2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1啟動子構建了小發卡RNA （small hairpinRNA ，shRNA ）表達載體pSUPER，并證實轉染該載體可有效、特異性地剔除哺乳動物細胞內目的基因的表達，為利用RNA i技術進行基因治療研究奠定了基礎。
2RNA i的應用
2.1RNA i在探索基因功能中的應用：人類基因組計劃的完成標志著后基因組時代的來臨。闡明人類基因組中功能基因表達產物的生物學作用對醫學發展有著深遠意義。在 RNA i技術出現以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遺傳學（reverse genetics）研究手段，但其技術難度較高、操作復雜、周期長。由于RNA i技術可以利用siRNA 或siRNA 表達載體快速、經濟、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達，所以現在已經成為探索基因功能的重要研究手段。同時siRNA 表達文庫構建方法的建立，使得利用RNA i技術進行高通量篩選成為可能，對闡明信號轉導通路、發現新的藥物作用靶點有重要意義。
2.2RNA i在基因治療領域中的應用：RNA i作為一種高效的序列特異性基因剔除技術在傳染性疾病和惡性腫瘤基因治療領域發展極為迅速。在利用RNA i技術對HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等進行基因治療研究中發現，選擇病毒基因組中與人類基因組無同源性的序列作為抑制序列可在抑制病毒復制的同時避免對正常組織的毒副作用。同時將抑制序列選擇在特定的位點，可對部分有明確基因突變的惡性腫瘤細胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病細胞產生凋亡誘導作用。此外尚可通過使用腫瘤特異性啟動子如hTERT啟動子、survivin啟動子或組織特異性啟動子如酪氨酸酶啟動子、骨鈣素啟動子引導針對某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA 或shRNA 表達，從而達到特異性殺傷腫瘤細胞的目的。
3RNA i在整形外科領域的應用前景
已證實N-Ras或BRAF的激活型突變是引發黑素瘤的主要病因，其中66%的病例為BRAF激酶作用域突變。而約80%的BRAF突變病例是因胸腺嘧啶突變為腺嘌呤造成第599位的纈氨酸突變為谷氨酸所致。使用RNA i技術剔除黑素瘤細胞的BRAF表達，不僅抑制了腫瘤細胞生長，而且減弱了其侵襲能力，為黑素瘤基因治療奠定了基礎。
最近研究表明趨化因子受體CXCR4是乳腺癌轉移的重要調節因素，其配體CXCL12可趨化腫瘤細胞并調節其增生和侵襲特性。使用RNA i干擾技術剔除CXCR4證實該分子為原位移植腫瘤生長和轉移所必需。此外，剔除BCRP表達可以逆轉其介導的腫瘤耐藥。

瘢痕疙瘩是一種較為難治的疾病，目前尚無有確切療效的治療方法。使用特異性siRNA 剔除TGF-βII型受體表達可以抑制角膜成纖維細胞表達纖維粘連蛋白并降低其遷移能力。剔除CTGF表達可使皮膚成纖維細胞內I型和III型前膠原蛋白、堿性成纖維細胞生長因子、組織金屬蛋白酶抑制因子（tissue inhibitor of lloproteinase，TIMP）-1，TIMP-2和TIMP-3等基因表達水平降低。這些結果提示TGF-β信號轉導通路和CTGF均可能是瘢痕疙瘩治療的潛在靶點。
綜上所述，RNA i技術不僅在黑素瘤、乳腺癌等惡性腫瘤基因治療中有較好的應用前景，而且在腫瘤和瘢痕疙瘩治療靶點的高通量篩選過程中有較高的應用價值。