RNA甲基化研究

近期華人科學家辛辛那提大學陳建軍教授研究了METTL14和m6A RNA甲基化修飾在正常和惡性造血過程中的重要作用，表明SPI1-METTL14-MYB/MYC信號軸在髓系分化以及白血病發生過程中的作用。該研究于2018年1月發表在干細胞頂級期刊《Cell Steam Cell》（影響因子：23.394）。

研究背景：

每一年，“Nature Methods”都會對過去一年中推動生物學發展的技術方法做出總結，并評選出當年影響力最大的技術。2016年，表觀轉錄組分析（Epitranscriptome analysis）榮膺Nature Methods年度生命科學技術。Epitranscriptome廣義的指添加到核糖核苷酸上的一切修飾，并引起機體相關表型變化的現象。其中，RNA甲基化研究是表觀轉錄組學一面大旗，在世界引起了新的科研熱潮。N6-甲基腺苷（m6A）是真核細胞信使RNA（messenger RNAs，mRNA）最常見的內部修飾方式。許多證據表明mRNA或者非編碼RNA上的m6A修飾影響RNA的命運以及功能，并且在組織發育，晝夜節律，DNA損傷應答，性別決定和腫瘤發生等生理過程中都發揮重要的作用。然而，它在正常或者惡性造血過程中的功能依然不清楚，本文針對該方向展開系統的研究。

研究思路：

RNA甲基化修飾伴隨系統酶系協同作用，其中包括“Writer”-負責甲基轉移過程，“Eraser”-負責去甲基化過程，“Reader”-負責甲基化位點識別。RNA m6A甲基轉移酶以復合物形式存在，這個復合物由METTL3/METTL14異二聚體催化核心和一個調節亞基WTAP組成。 METTL3具有活化的甲基轉移酶結構域，能夠催化腺苷酸（A）為m6A，METTL14特異性促進METTL3識別RNA底物。科學家研究發現METTL14作為m6A甲基轉移酶復合體的重要組成部分，在正常造血干/祖細胞以及攜帶有t（11q23），t（15；17）或者t（8；21）急性髓系白血病細胞中有較高的表達水平，并且它在髓系分化過程中表達下調。沉默METTL14能夠促進正常的HSPC和AML細胞終末髓系分化，并且能夠抑制AML細胞的存活/增殖。在機制上，METTL14通過m6A修飾調節其靶基因（如：MYB，MYC）發揮致癌作用，并在蛋白質水平受SPI1的負調控。METTL14在AML疾病以及白血病干/起始細胞（leukemia stem / initiation cells， LSCs/LICs）的發展以及維持過程中必不可少。總之，該研究揭示了SPI1-METTL14-MYB / MYC信號軸在髓細胞和白血病中的作用，并強調了METTL14調控m6A修飾在正常和惡性造血中的關鍵作用。

研究一：METTL14在HSPC中高表達，隨正常髓細胞生成下調

作者首先檢測了不同小鼠骨髓細胞（BMCs）中m6A甲基轉移酶及去甲基化酶的表達量，發現c-Kit-型小鼠Mettl14及Fto表達量顯著性下調。同時，c-Kit-型小鼠mRNA修飾水平也存在顯著性下降現象。進一步檢測HSCs和祖細胞中的Mett14表達量，結果顯示Mettl14在HSCs和Lin-Sca-1 + c-kit+ （LSK） 細胞中高水平表達。確定Mettl14在定型或分化的骨髓譜系細胞中表達呈現下調趨勢后，作者進行細胞表型相關實驗，驗證Mettl14細胞功能。通過Mettl14干擾等實驗，作者發現隨著Mettl14在髓細胞生成過程中下調表達，其敲低進一步顯著促進了HSPC向髓樣細胞的分化，這意味著METTL14在抑制正常骨髓生成中起重要作用。作者后續發現Mettl14在急性髓性白血病細胞（AMLs）中有同樣的表達模式。

研究二：METTL14表達受SPI1負調控

在了解METTL14在骨髓生成過程中特異表達后，作者研究了其表達的轉錄調控因子。通過ChIP-Seq數據，發現造血調控因子，CEBPB, GABPA, ELF1, CEBPA以及 SPI1與METTL14上游啟動子區域具有結合位點。其中除SPI1是負調控外，其它因子都呈現正調控作用。敲除SPI1后，無論AMLs或CD34+ HSPCs中METTL14 mRNA及蛋白質表達水平均上調。通過ChIP-qPCR驗證SPI1與METTL14 啟動子區有6個結合位點。上述實驗結果證實，SPI1是METTL14負反饋調節因子。

研究三：RNA-Seq結合m6A-Seq

尋找METTL14生理底物作者結合RNA-Seq以及m6A-Seq在MM6及NB4細胞（不同AMLs）中尋找METTL14生理底物。RNA-seq顯示在兩個細胞系中，METTL14敲低時560個基因顯著下調，而377個基因顯著上調（p <0.05;倍數變化> 1.2）。基因集富集分析（GSEA）顯示相對于對照細胞，造血/白血病干細胞中下調的基因主要富集MYB下調靶基因。MM6和NB4細胞m6A-seq結果中鑒定出16,675和18,831個m6A峰，其對應于8,246和9,632個轉錄產物。與前期研究一致，m6A峰常規Motif為GGAC序列，且甲基化峰主要位于基因啟動子區域。作者結合miCLIP證實，METTL14敲低時mRNA甲基化的變化主要由內部m6A，而不是5'Cap m6Am導致。

研究四：MYB及MYC為METTL14靶基因

分析m6A-seq及m6A-qPCR結果，發現在METTL14敲低時，MYB和MYC的m6A修飾豐度顯著降低。CLIP實驗直接證實METTL14直接結合MYC及MYB轉錄本。并且METTL14敲除AML細胞系中，MYB及MYC的表達量顯著下調控。除人源細胞系，作者還發現Mettl14敲除小鼠C-Kit+ HSPC中MYB及MYC轉錄本上m6A修飾減少，并且兩種基因表達量均下降。熒光素酶報告實驗證實，METTL14主要通過調控MYB及MYC甲基化水平，進而調控二者的表達水平。

參考文獻： METTL14 Inhibits Hematopoietic Stem/Progenitor Differentiation and Promotes Leukemogenesis via mRNA m6A Modi?cation.