RNAi基因沉默方法

大約在十年前，2006年諾貝爾生理/醫學獎得主CraigMello和AndrewFire發現，他們能夠將短RNA 分子插入到線蟲中并沉默特定基因的表達。今天，研究人員也常常使用這種強大的RNA 干擾方法來研究哺乳動物系統中的特定基因功能。
為了進行這種基因沉默實驗，研究人員通常需要依賴化學合成的RNA 分子，而這個合成過程是相當昂貴的。本月《冷泉港實驗手冊》（ColdSpringHarborProtocols）上的一篇免費文章就這個問題進行了討論。該文章描述了一種能產生沉默RNA （esiRNA ）以有效靶向哺乳動物細胞中的任何基因的很劃算的方法。
這篇文章（http://www.cshprotocols.org/cgi/content/full/2007/16/pdb.prot4824 ,）描述了如何在體外利用酶合成RNA 分子，該方法利用克隆的感興趣基因作為模版。接著，這些RNA 分子被隨機分割成短的片段，純化后用于RNA 干擾實驗。

這種方法是由德國馬克思?普朗克分子細胞生物學和遺傳學研究所的FrankBuchholz研究組發明，能夠用于制備大的esiRNA 庫以用于大規模的基因功能研究（http://www.mpi-cbg.de/esiRNA / ,）。
本月《冷泉港實驗手冊》中另外一篇重點文章還描述了如何利用胎鼠培養胸腺細胞（http://www.cshprotocols.org/cgi/content/full/2007/16/pdb.prot4808 ,）。胸腺是脊椎動物免疫系統的重要組成部分――T細胞的發源地。胎鼠胸腺器官培養是體外研究T細胞成熟過程的唯一可利用系統，并且這種操作方法將能幫助希望了解T細胞成熟機制的研究人員。該文章的作者是英國伯明翰大學MRC免疫調節研究中心的GrahamAnderson和 EricJ.Jenkinson撰寫。
最新發布的這個實驗手冊的文章還包括成像斑馬魚的神經元活動、分析果蠅和青蛙的基因表達模式、制備用于基因分型研究的哺乳動物DNA和鑒定蛋白質相互作用的文章。

RNA i現象的發現，加速了后基因組時代基因功能的研究步伐，更重要的是，RNA i自身可以應用于臨床治療，有望在未來幫助科學家開發出治療疾病的新療法。美國《科學》(Science)雜志連續三年將其評為十大科學突破之一，并于 2002年將其評為十大科學突破之首。
科學家公認，RNA i的研究將是未來十年生物醫藥研究中最激動人心也最有可能產生豐富成果的領域之一。在提出后短短幾年，RNA i這一項舉世矚目的技術得到諾貝爾獎的青睞和肯定，其發現者Dr.AndrewFire和Dr.CraigMello獲得了2006年諾貝爾生理學或醫學獎。
RNA i是在研究秀麗新小桿線蟲（C.elegans）反義RNA （antisenseRNA ）的過程中發現的，由dsRNA 介導的同源RNA 降解過程。1995年，Guo等發現注射正義RNA （senseRNA ）和反義RNA 均能有效并特異性地抑制秀麗新小桿線蟲par-1基因的表達，該結果不能使用反義RNA 技術的理論做出合理解釋。直到1998年，克雷格?梅洛博士和卡耐基研究院的Dr.AndrewFire證實Guo等發現的正義RNA 抑制同源基因表達的現象是由于體外轉錄制備的RNA 中污染了微量dsRNA 而引發，并將這一現象命名為RNA i。
此后dsRNA 介導的RNA i現象陸續發現于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等多種真核生物中，并逐漸證實植物中的轉錄后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA 介導的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）現象均屬于RNA i在不同物種的表現形式。
1999年，Hamilton等首次在PTGS植株中發現了長度為25nt的RNA 中間產物。2000年，Zamore和Hammond等使用體外培養的果蠅細胞進行研究發現，外源性dsRNA 通過耗能過程降解成21-23nt的小干擾RNA （smallinterferingRNA ，siRNA ）引發RNA i。
2000年，Wianny和Svoboda等分別證實在小鼠胚胎細胞和卵母細胞中dsRNA 能引發RNA i效應。2001年，Elbashir等證實21nt的siRNA 可在避免激活dsRNA 依賴的蛋白激酶(dsRNA -dependentproteinkinase，PKR)和2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'- oligoadenylatesynthetase，2',5'-OAS)信號轉導途徑的同時，有效抑制人胚腎293細胞、Hela細胞等哺乳動物細胞中目的基因的表達。
2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1啟動子構建了小發卡RNA （smallhairpinRNA ，shRNA ）表達載體pSUPER，并證實轉染該載體可有效、特異性地剔除哺乳動物細胞內目的基因的表達，為利用RNA i技術進行基因治療研究奠定了基礎。