RNAseq綜述（五）

第1階段-測序讀長的比對(alignment)與組裝(assembly)

測序完成后，分析的起點就是數據文件，這個數據文件包含了測序計數的堿基，這些數據文件通常是以FASTQ文件的格式存在。處理這些FASTQ文件最常見的第一步操作就是將測序讀長回貼到已知的轉錄組上（或已經注釋的基因組上），將每個測序讀長轉換為一個或多個基因組坐標。這一過程可以使用多個不同的比對工具，例如TopHat，STAR或HISAT，它們都依賴于一個參考基因組。由于測序的cDNA都源于RNA，而RNA有可能跨外顯子邊界，因此當與參考基因組（含有內含子與外顯子）進行比對時，這些工具進行一個剪接比對后，測序讀長之間會出現一些間隙。

如果測序的物種沒有一個可用的高質量基因組注釋（含有已經知的外顯子邊界），或者說如果希望將測序讀長與轉錄本（而不是基因）關聯起來，那么可以使用比對的讀長進行轉錄組的組裝。一些組裝工具，例如StringTie，SOAPdenovo-Trans使用利用那些已經比對好的結果中的空隙來推測其外顯子邊界，以及可能的剪接位點。當參考基因組注釋沒有或者是不完整時，或者是你感興趣的組織（例如在腫瘤組織）中轉錄本異常的情況下，這些從頭組裝轉錄本的工具尤其好用。當使用的是雙端測序和/或更長的測序技術時，這種轉錄組組裝方法效果更好，因為這些測序技術有更大的可能性跨越了剪接位點。但是，從RNA-seq數據中進行轉錄本的完整組裝對于計算DGE來說，并不是一個必需的步驟。

最近，已經開發出了計算高效的“免比對”(alignment-free)工具，例如Sailfish，Kallisto與Salmon，這些工具可以直接將測序讀長與轉錄本進行關聯，從而無需單獨的定量步驟（參考后面的第2階段部分）。這些工具在那些表征更高豐度（以及更長的）轉錄本方面表現得非常良好；然后它們在那些定量低豐度或短轉錄本方面表現不佳。

用于將測序讀長回貼到轉錄本的不同的工具在它們如何對測序的子集進行分配方面有著顯著的差異，這會影響最終的表達估計值。當有來自一個不同基因，偽基因或轉錄本的多個讀長時，這種效果尤為明顯。一項比對12個基因表達估計方法的比較顯示，一些比對方法低估了許多與臨床相關的基因的表達，這主要是由于其并不精確的回貼讀長所導至的。在RNA-seq數據的計算分析中，如何將多個回貼的讀長合理進行分析仍然是一個值得研究的方向。通常的做法是將這些讀長排除在下一步的分析之外，但這可能會使結果產生偏（參考階段2-轉錄本豐度的量化）。其它的估計包括生成“合并“表達特征，這些特征包含了那些共同回貼后的讀長的重疊區域，以及要在隨后的置信度計算中，對每個估計的基因的回貼的不確定性進行估計。

第2階段-轉錄本豐度的量化

一旦讀長被回貼到基因組的位置或轉錄組的位置，接下來的步驟就是將這些讀長分配到基因或轉錄本上，以確定它們的豐度。不同的比較研究表明，在量化步驟中采用的不同的方法對最終的結果影響最大，這種影響甚至超過了第1步中比對工具的選擇。對每個基因(即該基因所有轉錄本的亞型)測序讀長豐度的量化依賴于轉錄組注釋來對那些重疊到已知基因上的測序讀長進行量化。但是，使用短讀長對測序讀長進行特定異構體分配來說還需要一個估計步驟，因為許多讀長并不能跨越剪接位點，因此它們無法精確地分配給特定的異構體。當一個基因的主要表達形式是在不同長度的轉錄本之間進行轉換時，那么即使在僅研究基因層面的差異表達分析的前提下，對這些轉錄本進行定量則會產生一個更加精確的結果。例如，在一個樣本中，一個主要的轉錄本也許只有另外一個樣本中同樣轉錄本的一半長度，但是前者的表達量是后者的2倍，那么單純地基因基因定量的工具無法區分這個轉錄本的差異表達。

常用的量化工具包括RSEM，CuffLinks，MMSeq與HTSeq以及前面提到的那些免比對工具。一些基于讀長計算的工具，例如HTSeq（或者是R equivalent，featureCounts）通常會丟棄許多比對好的讀長，包括那些回貼到多個位置的讀長，或者是重疊多個表達特征的讀長。其結果就是，在隨后的分析中清除了那些同源和重疊的轉錄本。RSEM會使用期望最大化的方法來分配那些比對不明的讀長，Kallisto這個無參比對工具會將比對不明的讀長包括在它們相應的轉錄本計數中，從而導至結果偏倚。使用tximport包可以將轉錄本豐度估計轉化為讀長計數值(read count equivalents)。量化步驟中產生的結果通常會合并為一個表達矩陣，在這個矩陣中，每一行是表達特征（基因或轉錄本），每一列是樣本名，表達矩陣中的值要和是實際的讀長值，要么是一種估計豐度。

第3階段-過濾和歸一化

通常來說，定量后的基因或轉錄本計數結果還需要過濾和歸一化，從而用于解釋讀長深度，表達模式以及技術偏倚。過濾用于去除那些不均一的低讀長豐度特征的值，從而提高對那些真正差異表達值的檢測能力。而對表達矩陣進行歸一化則更加復雜。直接轉換可以調整豐度值，以便能更加說明GC含量的差異以及讀長深度。早期用于歸一化的方法就是RPKM，但這種方法現在已經淘汰，它已經被那些能夠校正樣本之間更細微差異的方法所取代，例如四分位數法或中位數歸一法。

廣泛的研究表明，歸一化方法的選擇會對最終的結果以及生物學結論產生重要的影響。大多數進行歸一化的算法依賴于兩個重要的假設：第一，大多數基因的表達水平在重復的樣本組之間保持不變；第二，不同的樣本組在總體的mRNA水平上不表現出顯著差異。當這些基礎假設不成立時，那么就需要慎重考慮是否進行歸一化，以及如何進行歸一化。例如，如果一些基因在一個樣本中高表達，同時相同的基因，以及另外的一些基因在同一組中的另外一個樣本里正常表達，如果對讀長深度進行簡單的歸一化則明顯不夠，因為相同數目的測序讀長會分配到第二個樣本里更多的基因上面。歸一化過程，例如截斷均值化M值(The Trimmed Mean of M-values,TMM)方法（它已經整合到的edgeR包中）就能解決這個問題。選擇一個合適的歸一化方法或許很困難；一種做法就是深度使用多種方法進行分析，然后比較它們結果的一致性。如果結果對于歸一化方法高度敏度，則應該對數據進行進一步的探索，以確定差異來源。但是，比較不同的歸一化方法時，要謹慎確保這種歸一化方法的比較不是為了選擇與原始假設最兼容的歸一化方法。

處理這些問題的一種方法的spike-in control RNAs，這種方法會引入一些外源已知的RNA序列，這些外源已知的RNA序列已知，濃度已知，在建庫的過程中，將它們添加到樣本中。RNA-seq中的Spike-ins方法包括外部RNA控制協會混合物(External RNA Controls Consortium  mix, ERCCs)，spike-in RNA突變物(spike-in RNA variants, SIRVs)與測序spike-ins(sequencing spike-ins, Sequins)。由于預先知道spike-in的濃度，這些濃度直接與生成的讀長數相關，因為就可以對這些來自樣本轉錄的表達水平進行校正。也有人指出，如果不進行spike-in控制時，那么就不能對那些有強烈倍數變化基因的實驗進行分析。然后在實踐中，很難在預設水平上一致地整合spike-ins，并且它們在基因水平上對測序讀長數目進行歸一化比轉錄本更加可靠，因為在一個樣本中，每個異構體的表達水平不同。目前，spike-in控制法并沒有在發表RNA-seq DGE實驗中得到廣泛使用，如果這種方法被進一步改進，提高其一致性的話，則這種方法會得到廣泛使用，但現在很多研究者們在他們的單細胞實驗（這種實驗里會更加廣泛地使用spike-in）使用了這種方法。

第4階段-差異表達的統計建模

一旦測序讀長被處理為表達矩陣，那么就可以對實驗進行統計建模，從而確定哪些轉錄本發生了改變。一些工具可以達到這些目的；其中一些工具會對基因水平的讀長數目進行統計建模，而一些則依賴于轉錄本水平的估計。基因水平的工具通常依賴于比對好的讀長數目，使用廣義線性模型(Generalized Linear Models)處理這些數據，從而能夠評估復雜的實驗設計。這些工具包括edgeR，DESeq2以及limma+voom，這些工具能夠進行有效地計算，并提供比較結果。對差異異構體表達進行統計建模的工具包括CuffDiff，MMSEQ與Ballgown，這些工具通常需要更多的算力(computational power)，并且不同工具的結果中的信息量更大。但是，在進行選擇差異表達工具之前做的那些工作，例如比對，定量或過濾以及歸一化這些操作對最終結果的總體方差會產生更大的影響。

常規的RNA-seq分析流程，相信關注我們生信技能樹的粉絲早就跟著一遍又一遍的學習了，這里就不再贅述，直接上視頻，需要掌握下面3個視頻課程的知識點，見：https://space.bilibili.com/338686099/#/

常規RNA-seq進階

源于整塊組織和/或大量細胞的RNA-seq數據已經徹底改變了我們對生物學的理解，但是這種常規的RNA-seq無法輕易地分辨出特定的細胞類型，也無法保存空間信息，而這兩個信息都是理解生物系統復雜性的關鍵因素。促進研究者們從常規的RNA-seq走出去的情形與常規RNA-seq當初出現的理由類似，但這種進階能夠能夠解決很多不同的問題。單細胞測序讓人們發現了，即使在被認為研究透徹的疾病背后，還存在著一些未知細胞類型，例如發現了離子細胞(ionocyte cell)，這類細胞可能與囊性纖維化疾病有關。空間分辨RNA-seq則提示了在實體組織中細胞與細胞之間的相互作用，例如發現了成年心臟組織中一小群胎兒標記基因表達的細胞。雖然在可預見的未來，常規RNA-seq仍然是一個占據主導地位的工具。但是，單細胞測序與分析方法正在快速地被研究者利用，并且隨著空間RNA-seq方法的成熟，它們有可能成為常規RNA-seq分析中的一部分。這兩種方法都將提高我們對多細胞生物體復雜性的理解，它們都有可能與常規RNA-seq方法結合使用。在這里我們簡單描述一下主要的單細胞測序以及空間RNA-seq方法，以及它們與常規RNA-seq的不同之處，以及新的研究者們如何著手。