ROS檢測方法總結

活性氧（reactive oxygen species，ROS）指來源于氧的自由基和非自由基，包含了超氧陰離子（O2?-）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（?OH）、臭氧（O3）和單線態氧（1O2）等，由于它們含有不成對的電子，因而具有很高的化學反應活性。

ROS在細胞生命，應激和死亡中具介導作用，并且不同濃度的ROS在其中起著截然不同的作用，從而導致細胞命運的不同。因此，非常有必要對ROS的濃度或相對水平進行可靠的測量。

1、電子順磁共振技術(EPR)

2、熒光染色法

3、化學發光法

4、色譜方法

5、分光光度法

6、電化學生物傳感器

7、基于熒光蛋白的方法

1、電子順磁共振技術 ( electron paramagnetic resonance , EPR )

EPR是一種檢測自由基的波譜學方法,是明確評估生物系統中以氧氣為中心的自由基生成的“金標準”。由于O2?-,?OH反應活性高、壽命短EPR信號不易直接檢出, EPR與自旋捕獲技術( spin tranps )相結合可彌補這一缺陷。首先自旋電子捕獲劑與自由基發生反應生成EPR易檢的相對穩定的自由基附加生成物,然后用EPR技術進行測定。它是一種功能強大且可靠的技術，可以明確地測量生物樣品中的O2?-，?OH和NO。

2、熒光染色法

熒光探針通常對氧化劑敏感，并且在被氧氣氧化之前是非熒光性的。使用最廣泛的成員是二氫乙啶（DHE），二氯二氫熒光素（DCFH-DA）和Amplex Red（盡管細胞不可滲透）。細胞可滲透的物質有助于反映細胞區室的氧化狀態，提供有關刺激下自由基產生的信息。這些探針大多數通過單電子自由基機理被氧化，產生探針自由基中間體并產生熒光產物。DHE能夠進入細胞并被細胞內O2?-氧化形成特定的紅色熒光2-羥基乙啶（2-OH-E+），或可以被其他氧化劑（?OH, H2O2, or OONO-）氧化生成非特定的紅色熒光乙錠（E+），2-OH-E+和E+均可通過基于熒光的技術任意捕獲。DCFH-DA通常用于直接測量細胞內的氧化還原狀態。它能夠進入細胞并被酯酶水解成不可滲透膜的DCFH，它可以在內部擴散并被非特定的氧自由基氧化，從而通過非熒光的中間自由基DCFH生成熒光的DCF。Amplex Red用于檢測過氧化氫。

3、化學發光法

化學發光分析通常用于超氧化物的檢測。與熒光分析類似，化學發光探針對自由基敏感，易于操作。探針可以與O2?-形成光子，并由光度計吸收計數器捕獲，而無需使用激發光光源。反應涉及多個步驟，并且探針自由基中間體在該機制中也起著關鍵作用，因此發光探針的局限性也與熒光探針類似。常用的化學發光試劑有魯米諾( luminol )、光澤精( lucigenin )、甲殼動物熒光素(如海螢熒光素)等。

4、色譜方法

色譜法用于羥基自由基及其反應產物的分離和鑒定。?OH與特定的試劑反應，生成可通過色譜分析檢測到的穩定化合物，其中通常使用液相色譜及其與質譜的組合。通常用于穩定自由基的試劑是苯甲酸，水楊酸和DMSO。水楊酸與羥基自由基反應生成的2,3-二羥基苯甲酸（2,3-DHBA）和2,5-二羥基苯甲酸（2,5-DHBA）通過HPLC并使用電化學檢測器進行定量，證明此方法可用于體內測量羥基自由基。基于HPLC的方法已應用于許多反應系統和組織中的羥基自由基或抗氧化劑活性的檢測

5、分光光度法

分光光度法是檢測ROS的悠久方法。它們基于自由基和氧化還原物質之間的反應而起作用，并且底物和產物之間在不同波長下的吸光度差異使自由基的半定量化成為可能。最常用的方法有細胞色素C ( cytochrome C )的O2?-還原法和氮籃四唑( nitro blue tetrazolium , NBT )還原法。

6、電化學生物傳感器

由金絲電極上的細胞色素c和聚苯胺（磺酸）的交替層形成的電化學生物傳感器（如下圖）用于超氧化物的定量。

7、基于熒光蛋白的方法

基于熒光蛋白的氧化還原探針是通過熒光蛋白（FPs）和原核氧化還原敏感蛋白的組合而設計的。重組蛋白通過質粒或腺病毒被引入細胞，并靶向亞細胞器，從而報告某些區域的氧化還原狀態。重組蛋白的氧化還原依賴性熒光光譜變化是通過在氧化條件下二硫鍵和部分主鏈的結構變化實現的。