RTPCR實驗原理及注意事項

一、實驗方法原理

逆轉錄-聚合酶鏈反應 （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR） 的原理是：提取組織或細胞中的總 RNA，以其中的 mRNA 作為模板，采用 Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成 cDNA。再以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。

二、注意事項

1、在實驗過程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在總 RNA 的提取過程中，注意避免 mRNA 的斷裂；

2、為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照；

3、內參的設定：主要為了用于靶 RNA 的定量。常用的內參有 G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。

其目的在于避免 RNA 定量誤差、加樣誤差以及各 PCR 反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；

4、PCR 不能進入平臺期，出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標 DNA 起始的數量有關。

故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環數，均應通過單獨實驗來確定；

5、防止 DNA 的污染： 采用 DNA 酶處理 RNA；在可能的情況下，將 PCR 引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和 mRNA 的共線性。