SDS法分離植物DNA

實驗概要

Dellaporta，Wood 和 Hicks (1983) 法分離植物總基因組DNA，通過實驗掌握SDS法從植物葉片提取DNA 的原理和方法。

主要試劑

提取緩沖液 [ 詳細信息：100mM Tris.Cl,；50mM EDTA； 500mM Nacl；40mmol/L 巰基乙醇，隨用隨加。]

液氮

異丙醇

TE緩沖液

無水乙醇

70%乙醇

KAC  [ 詳細信息： 5mol/L KAC。]

主要設備

移液器

冷凍高速離心機

臺式高速離心機

水浴鍋

陶瓷研缽

離心管 [ 詳細信息：離心管，50ml，有蓋。]

離心管 [ 詳細信息：離心管，5ml 和 1.5ml規格。]

小玻棒 [ 詳細信息：小玻棒，彎成鉤狀的。]

實驗步驟

1.  將2g經去淀粉處理的新鮮植物組織置于液氮中速凍,用研缽磨成細粉.

2.  將冷凍粉末轉移至一50mL 離心管中并加入15mL提取緩沖液。輕輕旋轉混勻。

3.  加入1mL 20% SDS，混勻，65°C保溫10min 并不時輕輕旋轉混勻（要點1）。

4.  加入5mL 5mol/L KAC，混勻后冰上放置20-30min（要點2）。

5.  25000g，4°C離心20min。

6.  上清用雙層Miracloth紗布過濾，轉移至一干凈的50mL離心管中，加入10mL異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20°C放置40min沉淀核酸。

7.  2000 g，4°C 離心20min，去上清，晾干沉淀5min。

8.  用700uL 50TE 緩沖液溶解沉淀并轉移至一 Eppendorf 管中（要點3）。

9.  加入7uL RNase A 貯液，37°C保溫1h。

10.  加入75 uL 3mol/L KAc，輕彈混勻，離心15 min沉淀不溶性雜質。

11.  將上清轉移至一裝有500uL 異丙醇的干凈管中，輕輕混勻，室溫下放置5min。

12.  微量離心機離心15min沉淀DNA，去上清并用500uL 70%乙醇清洗沉淀。再次離心5min，用巴斯德玻璃吸管吸去乙醇。

13.  沉淀物溶解于200uL TE 緩沖液中，4°C保存。

注意事項

1.  將SDS溶液加入到化凍的提取物中時，可能會有沉淀析出，要保證析出的SDS重新溶解，以及 65°C保溫時提取物混合均勻。 

2.  在高濃度（>1 mol/L)的鉀離子存在的情況下，十二烷基磺酸鈉(SDS)會與蛋白或多糖結合變成不溶性的十二烷基磺酸鉀復合物，這類復合物通常呈絮狀，必須要經較高轉速離心和Miracloth紗布過濾予以去除。

3.  若沉淀難于重新溶解，可在65°C加熱10min。