SDSPAGE的操作步驟

(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配制，也可以使用碧云天生產的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(P0012A)。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。(主要分為濃縮膠和分離膠，配方可自己上網查下)
(2) 樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮[V1] 的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關文獻資料配制，也可以使用碧云天生產的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白[V2] 。
(3) 上樣與電泳
冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。
為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預染蛋白質分子量標準(P0066)。
電泳時電泳液可以使用碧云天生產的SDS-PAGE電泳液(P0014A/P0014B)。
電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標準電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設置在80-100V，高電壓可以設置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，也可以采用碧云天的多功能電泳儀(帶定時)(EEP102)。為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設置在100V，然后設定定時時間為90－120分鐘。設置定時可以避免經常發生的電泳過頭。
通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經被適當分離后即可停止電泳。
3. 轉膜(Transfer)[V3]
我們推薦在Western實驗中選用PVDF膜(FFP30/FFP33)。硝酸纖維素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產商的推薦使用步驟。
通常如果使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置，可以設定轉膜電流為300-400mA，轉膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉膜過夜。轉膜時也可以使用碧云天的多功能電泳儀(帶定時)(EEP102)。具體的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。
在轉膜過程中，特別是高電流快速轉膜時，通常會有非常嚴重的發熱現象，最好把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。
轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質分子量標準，通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進行染色，以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液(P0017)對完成轉膜的SDS-PAGE膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。
4. 封閉(Blocking)
轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液(P0023C)中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產生較高的背景[V4] 。
用微型臺式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸盡洗滌液，加入Western封閉液(P0023B)，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體[V5] ，可以4℃封閉過夜。在整個Western過程中我們推薦使用碧云天的側擺搖床(ESHK02)或類似儀器，側向擺動速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
參考一抗的說明書，按照適當比例用Western一抗稀釋液(P0023A)稀釋一抗。
用微型臺式真空泵或滴管等吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過夜。或根據抗體的說明選擇適當的孵育溫度和時間。
回收一抗[V6] 。加入Western洗滌液(P0023C)，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。
注：Western結果通常需要提供內參作為對照，通常可以選用Tubulin抗體(AT819)或Actin抗體(AA128)，進行內參檢測。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
參考二抗的說明書，按照適當比例用Western二抗稀釋液(P0023D)稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。 二抗需根據一抗進行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。碧云天有多種二抗提供。
用微型臺式真空泵或滴管等吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。
回收二抗。[V7] 加入Western洗滌液(P0023C)，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。
7. 蛋白檢測(Detection of proteins)
參考相關說明書，使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL類試劑來檢測蛋白。壓片可以采用專用的壓片暗盒(FFC58/FFC83)進行。
洗片時可以使用X光片自動洗片機。如果沒有自動洗片機，可以用顯影定影試劑盒(P0019/P0020)自行配制顯影液和定影液進行手工洗片。X光片推薦選用柯達原裝的生物實驗專用柯達X-OMAT BT膠片(FF057/FF081)。
8. 膜的重復利用(Membrane recovery)
如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液(P0025)處理蛋白膜，以重復利用蛋白膜。

[V1]為什么要加緩沖液？提取的樣品是等體積的么？ [V2]？ [V3]過程？傳膜之后怎么沒色？ [V4]？ [V5]蛋白？ [V6]還能反復利用？ [V7]還能反復利用？