SR技術的發展過程

在達到今天SR技術水平的過程中，承載了許許多多研究人員辛勤勞動的汗水，也面臨著諸多亟待解決的難題。

　　在以上這些光學SR成像技術中有兩種技術——受激發射減損顯微鏡(stimulated emission depletion microscopy, STED)和飽和結構光學顯微鏡(saturated structured illumination microscopy，SSIM)最受關注。

　　最近，基于探針SR成像技術的光敏定位顯微鏡(PALM)和隨機光學重建顯微鏡(STORM)，以及借助熒光基團隨機激活特性的熒光光敏定位顯微鏡(FPALM)都已經取得了成功。

　　通過基于探針的SR成像技術，可以獲得多張原始圖像。在每一張原始圖像中，細胞內只有一部分被熒光標記的分子能發出熒光，即這些熒光分子都處于不斷激活和滅活的交替狀態，每一次都只有部分分子能被觀察并成像。而且由于每次發出熒光的分子都分散得較為稀疏，因此相互之間不會受到影響，也就避免了因相鄰分子發出熒光而無法分辨的問題。最后將這些原始圖片疊加、重合在一起就得到了最終的高分辨率圖像。這樣，就能使得那些以前由于熒光點太密以至于無法成像的結構的分辨率達到納米級水平，而且成像的分子密度也相當高，可以達到105個分子/μm2。

　　這種分辨率對于生物學家來說，意味著現在可以在分子水平上觀察細胞內的結構及其動態過程了。

　　雖然顯微鏡技術已經發展到了如此高度，但它仍然只是生物學家研究中使用的一種工具。因此還需要將顯微鏡獲得的圖像與其它的試驗結果互相參照，才能獲得準確的結果。人們需要認清SR顯微鏡的優勢與劣勢，為操作以及判斷SR圖像制定出標準化的操作規范，只有這樣才能最大限度地發揮SR顯微鏡的作用。

　　現在，由于人們對細胞內各組份的組織結構以及它們的動態變化過程都只有一個概念上的認識，因此，借助顯微鏡從納米水平上對這些結構及過程進行真實的觀察能讓人們發現許多以往所不了解的東西。例如，以前人們通過電鏡發現細胞骨架是由大量絲狀網格樣組織構成時，就有人對此現象持懷疑態度。那些認為細胞骨架是一種用來稀釋細胞內生化物質濃湯這樣一種結構的細胞生物學家把這種觀測結果稱作僵化的人為試驗結果。

　　除非最新的SR顯微鏡圖像或者其它的試驗結果都能證明細胞骨架是由大量的絲狀網格樣組織構成的，否則還會有人持上述的懷疑觀點。不過已經有其它的生化試驗結果證實了早期的電鏡觀察結果是正確的。當然新興的SR技術也需要其它傳統的生化試驗結果予以佐證才有價值，同時還需要電鏡的輔助。因為電鏡能提供納米級的觀察結果，這對于佐證具有同樣分辨率的SR顯微鏡觀測結果來說是最有價值的。

　　今后，大家在逐步了解、接受和廣泛使用SR顯微鏡的同時，需要注意將會出現的各種問題，以下的表格列出了部分與SR顯微鏡使用相關的缺點及其目前的解決方法。

　　最近幾年，就如何處理圖像已經有了非常嚴格的操作規范。不過迄今為止，對于怎么處理SR圖像還沒有一個標準的操作規范。尤其需要指出的是，PALM和STORM數據在某些重要因素上，graph方面的共性要多于image方面。在一張SR圖像上，分子的不確定性和密度都能用顏色表示出來，這種圖像把細胞內該分子有可能出現的任何地點都標示出來了。而且只有被標記的分子按照一定的標準(發出的光子數)判斷它的確是一個單分子并且定位準確之后才顯示出來。必須對獲得的圖像進行這樣的標準化處理之后才能分析結果。同樣，對于試驗數據也需要如此進行標準化處理。要提高分辨率不僅需要分子定位、分布得比較好，還需要分子數目夠多，以致能達到尼奎斯特判斷法(Nyquist criterion)的要求，即分子間的平均距離要小于顯微鏡分辨率的一半。雖然上述問題都不會影響SR顯微鏡的應用，但由于存在這些問題，所以我們應該時刻提醒自己，一定要仔細判讀、分析SR顯微鏡的圖像結果，只有這樣才能得到有價值的生物學結論。

　　SR熒光顯微鏡在生物學研究中的應用

　　到目前為止，人們還很難得知，SR熒光顯微鏡會對生物學界的哪一個領域帶來重大變革，但已經有幾個領域出現了明顯的改變。這些研究領域是動態及靜態的細胞組織結構研究領域、非均質分子組織研究領域、蛋白動態組裝研究領域等。這幾個領域都有一個共同的特點，那就是它們研究的重點都是分子間如何相互作用、組裝形成復合物。因此，能在納米水平觀察這些分子對它們來說具有重大的意義。

　　通過觀察蛋白質之間的組合關系來了解它們的作用，并能為后續的細胞功能試驗打下基礎

　　結構生物學研究在這方面已經取得了很大的進展，目前已經發現了4-8納米大小的分子間相互作用組裝成細胞微管、肌絲、中間絲這些超過10微米大小聚合物的機制。不過對于核孔復合體、中心體、著絲點、中間體、粘著斑這些由許多不同蛋白經過復雜的三維組裝方式組合起來的復合體，還需要更好的辦法來進行研究。目標就是要達到分子水平的分辨率，這樣就可以觀察大復合體形成過程中的單個分子，也就能對這些分子的化學計量學有所了解了。要得到更多的生物學信息就需要SR顯微鏡這樣的三維成像技術，例如可以使用活體細胞SR成像捕捉細胞骨架的動態重構過程等等