SSR標記實驗步驟

植物葉片樣品

液氮 CTAB 氯仿異戊醇 異丙醇 TE 無水乙醇

離心管 冰箱 水浴鍋 離心機

取葉片→磨樣→提取DNA→PCR擴增→電泳檢測→染色→讀帶標記。

1、DNA提取

按照Doyle和Dickson（1987）CTAB法（`Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改進的程序進行，具體步驟如下：

①  成熟期取葉片加液氮研磨成粉末狀，轉入1.5ml離心管中，-20℃冰箱保存；

②  加入600μl 65℃的2×CTAB混勻并置于65℃水浴中保溫30-60分鐘；

③  取出，冷卻，上下搖勻后，加入600微升24:1的氯仿異戊醇；

④  12000轉/分鐘離心10分鐘，取上清液于另一個1.5ml的離心管中；

⑤  加異丙醇，12000轉/分鐘離心10分鐘，倒掉上清液；

⑥  干后用100%的灑精清洗，干后加適量TE。2、PCR擴增

模板DNA的濃度大約25ng/μl,擴增反應體系為20μl。具體如下：

Sterile ddH2O        11μl

PCR Buffer              3μl

dNTP-mix                 0.5μl

Primer1                     1μl

Primer2                     1μl

Taq polymerase      0.5ul（2U/μl）

DNA                            3μl  

PCR擴增程序為：（2h30min）  

①  預變性：94℃，5分鐘；

②  變  性：94℃，40秒；

③  退  火：55℃  40秒；

④  延  伸：72℃，1分鐘；

⑤  循  環：從2到4共38個循環；

⑥  72℃下最后延伸5分鐘；4℃ 5min，擴增產物置于4℃的冰箱保存。3、擴增產物的電泳分離

制膠→灌膠→上樣→電泳。

擴增產物用8%的聚丙烯酰胺變性膠電泳分離，步驟如下：

①  準備電極液（1×TBE）；

②  將梳子撥出，并迅速用電極液沖洗膠面；

③  不預電泳；

④  點樣，電泳220V；

⑤  拆板，并及時將內板、邊條及梳子洗凈。

4、凝膠染色

①  固定：10%醋酸，5分鐘；

②  染色：10分鐘；

③  漂洗：dH2O，5-10秒；

④  顯色：甲醛-NaOH，直到滿意為止；

⑤  漂洗：dH2O，2分鐘。

 5、自封帶封膠，讀帶標記，數碼照相攝像，室溫風干。

1、優點：

（1）標記數量豐富，具有較多的等位變異，廣泛分布于各條染色體上；

（2）是共顯性標記，呈孟德爾遺傳；

（3）技術重復性好，易于操作，結果可靠。

2、缺點：

開發此類標記需要預先得知標記兩端的序列信息，而且引物合成費用較高。