Science：宏基因組學測序技術

　　宏基因組學技術(Metagenomic approaches)正快速拓寬我們對微生物代謝能力(microbial metabolic potential)的認識。

　　長期以來，對微生物(microorganism)功能開展的研究主要依賴的都是以在實驗室里培養的單一物種(individual specie)為對象獲得的研究成果。大約在10年前，科研人員們開始獲得自然環境中存在的、非人工培養的細菌或古細菌(archaea)的基因組草圖，這些基因組數據為科研人員們了解這些微生物在自然環境中的作用打開了一條新的渠道。這就是所謂的宏基因組學(metagenomics)技術，該技術的發展現在已經可以做到從多個不同的環境樣本中快速、準確地獲得環境微生物的基因組序列。這些成果有可能會徹底顛覆我們對生命之樹結構，以及各個物種代謝能力的理解和認識。生物信息學的飛速發展也提供了另外一種便利，由于能夠全面了解遺傳信息和數據，所以能夠快速地為這些宏基因組數據在醫學診斷、農業、法醫以及生物技術等應用領域里找到合適的位置和用途。

　　宏基因組學技術是一種不需要進行微生物培養的微生物研究方法，可以直接對取自環境里的微生物樣品進行分析和研究。整個流程是先將樣品里的DNA提取出來，進行測序，然后用計算機軟件對測序結果進行分析。這種方法至少解決了兩個非常重要的問題。首先，該技術能夠讓我們對大自然里99%的微生物(這些都還是沒能在實驗室里成功培養的微生物)進行分析和研究。其次，可以對整個大環境里的微生物進行研究。

　　由于這些DNA來自不同的物種，所以從宏基因組數據中找出每一個物種的基因組序列是一件非常復雜的工作。直到最近，科學家們才成功地從擁有豐富基因型、同時又相對簡單的環境樣品中獲得了微生物的基因組序列。高通量DNA測序技術讓我們有能力對生物物種相對沒有那么豐富的環境樣品進行分析，也能夠確定擁有相當物種數量的環境。但是這會極大地增加數據分析工作的復雜程度和難度。新開發的計算機軟件可以對數據進行合并，并且將分屬于各個不同物種的基因組片段劃歸到相應物種的基因組里，這就是所謂的“框并法(binning)”。

　　2012年，Wrighton等人獲得了49個細菌的基因組序列(這些序列的完整程度不一)，這些細菌至少分屬于5個不同的門(phyla)，而在這之前我們對這些門類細菌的基因組信息幾乎可以說是一無所知。Wrighton等人使用的就是框并法，這種方法將時間序貫豐度信息(time-series abundance information)與序列組成信息組合在一起。最近，Albertsen等人也使用多個樣本的信息重建了31個基因組，這些基因組的平均完整性已經達到了80%。這一次使用的方法與分析人類嬰兒腸道微生物組的方法類似。Albertsen等人也能夠組裝出TM7門類細菌(這是一大類目前還不能在實驗室里培養的細菌)的完整基因組序列。科學家們也已經能夠組裝出在整個環境(比如海洋等)中只占1%的物種的完整基因組序列。最近還成功地獲得了成年人腸道和大便微生物組的序列。這些成功的案例都表明，基于宏基因組的基因組序列捕獲技術已經非常成熟，能夠用于對高度復雜系統的科研工作當中。

　　不過序列準確性還是一個問題，影響了部分人對這種以宏基因組學技術為基礎的測序技術的接受度。大家最關心的問題就是將來自不同物種的基因組序列給拼接到了一起。不過借助自動、或者人工的糾錯機制是可以修正這種組裝錯誤(Assembly error)的。而且我們還可以利用傳統克隆測序策略里使用的驗證機制來解決這個問題。很多時候，我們只需要將測得的序列與已經發表的、親緣關系比較接近的物種的序列進行比對就可以明確測得序列的真實程度，也可以使用長片段、高質量的DNA測序技術進行驗證。框并法是一種容易出錯的方法，的確需要格外小心。使用多個不同來源的信息，尤其是在多個樣本中物種豐度都非常獨特的物種信息(內參)能夠極大地降低錯誤發生的幾率。

　　基于基因組信息的抗生素選擇方案。能夠掌握整體情況，明確其中每一種微生物功能的宏基因組學技術對臨床工作也有一定的指導意義。如上圖所示，根據環境中每種微生物的豐度從高至低進行排序。其中圓圈代表基因組。圓圈上的各種符號和標記代表各種性狀，比如對抗生素的耐藥性或者底物代謝能力等。在治療之前(A)，具有益生菌活性的微生物含量很少，其中大部分都是致病菌。根據宏基因組學分析之后給予相應的抗生素進行治療，就能夠大量消滅致病菌，使益生菌的豐度明顯上升(B)。

　　除了宏基因組學技術之外，還有另外一種技術就是單細胞基因組測序技術，這也是一種不需要進行實驗室培養的測序技術，只需要從環境樣本中提取細胞并進行基因組測序就可以完成工作。最近，Rinke等人從多種不同的自然環境樣本中都成功地分離得到了單細胞標本，并且成功地進行了DNA擴增和測序，獲得了201個基因組(非完整基因組)。據估計，這些序列的平均完整程度達到了40%。據我們了解，到目前為止還沒有哪一個單細胞基因組測序工作能夠獲得完整的基因組序列。這種單細胞基因組測序工作獲得的序列基本上都是不完整的。Rinke等人開展的工作已經可以算是非常漂亮的工作了，他們獲得的最完整的基因組序列(認為該序列的完整程度幾乎接近100%)也是由10個片段拼接而成的，另外一個完整度達到99%的基因組序列更是由137個片段組成的。

　　用宏基因組學技術獲得的基因組片段很多都是不完整的(這主要是因為樣品不夠)，不過我們可以借助額外的測序工作加以彌補。可是對于單細胞基因組測序，再輔以其它測序似乎意義不太大。宏基因組學技術也不需要像單細胞測序技術那樣費時費力，也不需要進行細胞分選，而且還能提供更多的信息。因為宏基因組學技術獲得的是整體的信息。現在在基因組測序工作中使用的算法大部分都是株系特異性的(strain-specific)，很有可能會測出多態性堿基。另外，如果被測細胞里存在基因插入或者缺失的情況，那么有一部分測序結果可能就只能與參考序列部分吻合了。如果科研人員對整體代謝能力、整體結構(population structure)、整體多樣性或者進化動力學(evolutionary dynamics)等問題感興趣，這些信息就對他們會非常有幫助。另外一方面，單細胞基因組測序技術也能夠提供宏基因組學技術無法獲得的信息，比如基因變異連鎖信息(gene variant linkage information)等。

　　由于單細胞基因組測序技術和宏基因組學測序技術都獲得了廣泛的關注與認可，所以我們希望廣大的科研人員能夠使用定義非常明確的術語來描述基因組的完整性，以便于大家對這兩種技術的優缺點進行更客觀、更準確的評價。比如只有在經過仔細的檢驗之后，確認獲得了一個完整的、連續的、沒有錯誤或缺口的序列時，我們才可以稱這條序列是一個完整的基因組序列。如果因為存在重復序列，或者其它原因導致基因組組裝出現困難，得到了多條、而不是一條“基因組”序列，那么此時只能說得到了部分完整的基因組序列。根據Chain 等人的工作，我們可以認為這種有多條序列的基因組序列是一個基因組草圖。此時我們可以根據單拷貝基因名錄來衡量該序列的完整性。由于單拷貝基因通常在整個基因組基因中所占的比例還不到10%，而且在基因組中的分布并不均勻，所以根據單拷貝基因也只能大概估計序列的完整程度。

　　因此還需要更強大的基因組草圖完整性評估手段。使用在整個基因組中并非成簇存在的標志物基因(marker gene)也許是一個不錯的辦法。改進取樣技術，獲得更多不能培養的微生物的基因組樣本，從中發現更多、更普遍存在的基因也會有所幫助。這些信息能夠幫助科學家們從已知序列中發現更多的單拷貝基因。

　　隨著測序技術不斷發展，測序的速度、精度、信息豐富程度都有了大幅度的提升，高通量的宏基因組學技術也逐漸具備了給要求更快、更準確、特異性更高的整個測序診斷領域帶來革命性改變的能力。比如如果發展到了個體微生物組(personal microbiomics)時代，我們就可以快速地對病原體群耐藥基因進行測序和篩選，然后根據這些結果給出最合適的抗生素。根據宏基因組學數據還可以選擇性地刺激目標微生物群，治療肥胖癥或慢性腹瀉等疾病。更重要的是，如果掌握了生命之樹中很多之前還沒有被發現的基因組信息，將極大地豐富我們對生命和進化歷程的認識和了解。