Southern印跡及基因組DNA雜交技術實驗

基因組 DNA

限制性緩沖液

瓊脂糖凝膠

1. 7~20 μg 基因組 DNA 稀釋到 500 μl 合適的限制性緩沖液中。4℃ 過夜。

2. 每管加 10~20 單位限制性酶。孵育 4~6 小時。10 μl 消化液在小瓊脂糖凝膠上電泳檢測消化的程度。如果需要，就在消化液中補加酶。

3. 用乙醇沉淀消化物：加 50 μl 3 mol/L NaOAc，混勻。然后加 1 ml 100 % 乙醇并混勻，在 -20℃ 至少放 30 分鐘；或在干冰中放 10 分鐘。離心 20 分鐘（在離心機中定好管子的方向，這樣你知道沉淀的位置）。去掉上清。

4. 用 70% 乙醇洗一次：加 1 ml 70% 乙醇，離心 5 分鐘。去掉上清。離心 5 秒鐘使殘余液體流到管底。吸掉液體。在空氣中干燥 15 分鐘。同時著手進行步驟 5.

5. 0.7% 用 TAE 作為緩沖液的瓊脂糖凝膠。凝膠中含溴化乙錠以避免在后面進行凝膠染色。





6. 用 TE ( pH 8 ) 重懸沉淀物。

7. 慢慢地跑凝膠電泳；跑過夜或跑一整天（2.5 v/cm 凝膠長度可以允許凝膠跑過夜）。循環電泳緩沖液以避免形成 pH 梯度（緩沖液應該從陰極流到陽極）。

8. 沒有溴化乙錠的凝膠要染色 15 分鐘（在 1 L 用過的 TAE 緩沖液中加 15 μl 10 mg/mI 溴化乙錠）。拍照以保存凝膠記錄。

9. 準備把凝膠轉移到固相支持物上。

(1) 傳統方法

① 凝膠在 4~5 倍凝膠體積的 0.25 mol/L HCl 中孵育 15 分鐘去嘌呤。

② 換 3 次變性溶液洗凝膠（每次用 3~4 倍凝膠體積），洗 1 小時以上。

變性溶液（配 3 L）：

0.5 mol/L NaOH          60 g NaOH

1.5 mol/L NaCl            261 g NaCl

使用新鮮制備的溶液。

③ 換 3 次中和溶液中和（每次用 3~4 倍凝膠體積）1 小時以上。

中和溶液（配 3 L)：

1 mol/L Tris                363 g Trizme 堿

2 mol/L NaCl              350 g NaCl

                                 用 HCl 調 pH 到 6.5，約 100 ml

貯存在室溫。

④ 在 20 x SSC 溶液中進行轉移。

20x SSC 溶液（配 1 L)：

3 mol/L NaCl              175.3 g NaCl

0.3 mol/L 檸檬酸鈉      88.2 g 檸檬酸二氫鈉

                                 pH 調到 7.0

貯存在室溫。

(2) 堿轉移法：只可以使用帶正電荷的尼龍膜，用該方法硝酸纖維素會碎掉。

① 在 4~5 倍凝膠體積的 0.25 mol/L HCl 中孵育 15 分鐘使凝膠去嘌呤。

② 組裝毛細轉移裝置，20 x SSC 溶液換成 0.4 mol/L NaOH。

③ 在 0.4 mol/L NaOH（16 g/L）中進行轉移。

10. 按圖所述組裝毛細轉移裝置。



(1) 在組裝轉移裝置前，把膜、濾紙和紙巾切成適當的大小。進行毛細轉移時，液體必需在被紙巾堆吸收前通過膜。如果紙巾或濾紙接觸到凝膠或濾紙條，就會發生“短路'這種情況。這種情況可以通過依次縮小膜、濾紙和紙巾的大小來避免。給出的尺寸是用于 20 cm x 20 cm 的凝膠。對于不同大小的凝膠要調整尺寸。



(2) 在 20 X SSC 溶液里打濕濾紙條（26 x 35 cm 濾紙）并把它鋪在一塊玻璃平板上使兩端掛在盛有 1 L 20X SSC 溶液的平皿中。用一根玻璃吸管作為搟面杖，去掉任何玻璃和紙之間的空氣泡。

(3) 把凝膠放在濾紙條上。

(4) 先在水中然后在 20 x SSC 溶液中把膜打濕，并把膜放到凝膠上面。用吸管代替搟面杖去掉任何空氣泡。

(5) 在 20 x SSC 溶液中打濕濾紙（18.5 x 18.5 cm )，放在膜上，確定要放在中間。用吸管作搟面杖去掉空氣泡。

(6) 把 1 堆紙巾放在濾紙上（中間）。

(7) 蓋一塊玻璃或塑料板（如用干倒膠的托盤）并在上面壓重物（例如一個放滿液體的 500 ml 瓶子）。

11. 至少進行 16 小時的轉移。在拆除轉移裝置前，在孔的位置做上標記。

12. 如果你使用的是傳統方法，就用例如 Stratalinker 牌的紫外交聯儀把 DNA 交聯到膜上。如果你使用的是堿轉移法，就不要作交聯。

13. 在 2x SSC溶液中洗膜。幾分鐘后，用你的手指（戴干凈手套）輕輕地摩擦表面去掉所有黏附在濾膜上的瓊脂糖。在雜交分析中，黏附在膜上的瓊脂糖會造成很大的背景。

14. 用水洗膜并把它保存在干凈的紙巾之間，直至準備進行雜交分析操作。

在膜上陽性反應呈帶狀。實驗中應注意以下問題：轉膜必需充分，要保證DNA已轉到膜上。雜交條件及漂洗是保證陽性結果和背景反差對比好的關鍵。洗膜不充分會導致背景太深，洗膜過度又可能導致假陰性。若用到有毒物質，必需注意環保及安全。

分子雜交是基因探測的基礎，除了用印跡雜交外，還有斑點雜交法。即將DNA樣品變性后直接點在硝酸纖維濾膜上，再與探針雜交，或者將細胞或病毒點在膜上，菌落或菌斑原位地吸附在膜上，經過變性處理，再進行雜交。斑點雜交多用于病原體基因，如微生物的基因，但也可用于檢查人類基因組中的DNA序列。

本實驗來源《細胞實驗指南》 黃培堂 等譯。