T7RNA聚合酶系統基因表達實驗

實驗方法原理

含有 pT7 控制的外源基因（「痘苗病毒系統基因表達實驗」中「重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染」）的重組質粒，通過同源重組可整合到痘苗病毒中,并制備重組病毒儲液。將此病毒儲液與 vTF7-3 共同感染貼壁或懸浮細胞，在培養過程中，外源基因被高效的 T7 RNA 聚合酶轉錄，并在感染細胞的細胞質完成翻譯。隨后進行分析鑒定或純化蛋白質。

此共感染方案適用于大量生產蛋白質，基于這種目的，常使用懸浮培養的細胞（如 Vero 或 HeLa S3）。

實驗材料 vTF 7-3 痘苗病毒儲液含有 pT7 控制的外源基因的重組病毒儲液貼壁培養的單層 CV-1 細胞／轉瓶懸浮培養的 HeLa S3

試劑、試劑盒 完全 MEM-10、轉瓶 MEM-5 或 MEM-2.5 培養基胰酶（過濾除菌后凍存于 -20℃）

儀器、耗材 Sorvall 離心機6 孔組織培養板／用于擴大分析的大組織培養瓶

實驗步驟

1. 對于貼壁培養的單層細胞：

1.1 感染 CV-1 貼壁單層細胞：在病毒感染前一天，用完全 MEM-10 培養基將 5 × 105 細胞/孔加入 6 孔組織培養板培養，直至細胞幾乎匯片生長（一般過夜）。

1.2 胰酶消化病毒儲液。每份病毒儲液加入等體積的 0.25 mg/ml 胰酶，渦旋混勻，溫育 30 min，每隔 5～10 min 晃動一次。

MOI 為 10 pfu/細胞可以獲得高水平的蛋白質表達。

如果還有團狀物，將其冷卻到 0℃，冰上超聲 30 s。可以重復幾次超聲，但超聲的間隔中樣品應當置冰上冷卻（見「痘苗病毒系統基因表達實驗」中「重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染」）。

1.3 將兩種胰酶消化的病毒儲液混合。

1.4 將胰酶處理后的病毒用 MEM-2.5 培養基稀釋至 4 × 107 pfu/ml (每種病毒為 2 × 107 pfu/ml）。

1.5 吸出培養基，用 0.5 ml 的病毒混合液感染 6 孔板中每孔的細胞，溫育 1～2 h，每隔 15～30 min 晃動一次。

1.6 加入 2 ml 的 DMEM-10 培養。根據使用的方法，在感染后 5～24 h 分析基因表達。如果純化蛋白質，在感染 2～3 天后收獲細胞。

注：盡管在感染后數小時就可以檢測基因表達，但一般在病毒感染的晚期進行免疫沉淀、免疫印跡或 Northern 印跡分析，因為這時 T7 控制的基因產物積聚到最高水平。早期分析一般檢測表達蛋白的生物學活性。

2. 對于懸浮培養的細胞：

2.1 感染 HeLa S3 懸浮細胞：在病毒感染前，用血球計數器對細胞進行計數, 在室溫下 1800 g 離心 5 min，棄上清。用轉瓶 MEM-5 培養基重懸細胞至 2 × 107 細胞/ml，將其轉移到較小的無菌組織培養瓶或 Erlenmeyer 瓶中。

2.2 胰酶消化病毒儲液。每份病毒儲液加入等體積的 0.25 mg/ml 胰酶，渦旋混勻，溫育 30 min, 每隔 5～10 min 晃動一次。

MOI 為 10 pfu/細胞可以獲得高水平的蛋白質表達。

如果還有團狀物，將其冷卻到 0℃, 冰上超聲 30 s。可以重復幾次超聲，但超聲的間隔中樣品應當置冰上冷卻（見「痘苗病毒系統基因表達實驗」中「重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染」）。

2.3 將兩種胰酶消化的病毒儲液混合。

2.4 將胰酶消化病毒混合物加入濃縮細胞中，37℃ 懸浮培養。

2.5 將感染后的細胞加入到大的旋轉培養瓶中，用轉瓶 MEM-5 培養基將其稀釋至 5× 105 細胞/ml，37℃ 懸浮培養 1～3 天。

2.6 收獲細胞，分析或純化表達蛋白（見步驟 1.6 注釋）。

注意事項

1. 所有培養都在加濕的 37℃ 5% CO2 培養箱中培養，除非有特殊說明。

2. 與活細胞接觸的器械和試劑都應該是無菌的，操作也必須無菌。