點樣：將試樣溶液用毛細管在層析板上距離板底部約1.5厘米的位置點若干下（次數根據樣品濃度而定），并靜置頃刻（或加熱）以使溶劑完全蒸發。若溶劑難以揮發，則點樣之后需要將板放于真空容器中干燥后再使用。溶劑的蒸發是必須的，否則殘留的溶劑會與流動相作用，降低流動相的均一性，導致分離效果變差。
將少量合適的溶劑（流動相）倒于一個合適的玻璃器皿（展缸）中，讓流動相高度不超過1厘米，并在上面放上表面皿使溶劑蒸氣在展缸中飽和。可在展缸底部放上一張濾紙，讓濾紙底部浸沒于溶劑中并靠在展缸內壁，過幾分鐘后讓洗脫溶劑蒸發并在展缸空間內飽和。若不經過以上步驟可能會導致分離度的下降或使結果不具重復性。
然后將層析板置于展缸內（樣品點不可觸碰溶劑表面），蓋上蓋子讓溶劑通過毛細現象緩慢爬升。溶劑遇到樣品混合點時，會帶著樣品上升（即洗脫樣品）。當溶劑快到層析板頂端時，將板拿出，迅速記錄溶劑到達的高度并晾干。不要讓溶劑爬升到達板的頂部。