WesternBlot的過程與優化，著重于化學發光檢測

實驗步驟

一、蛋白質印跡法

蛋白質印跡 (Western Blotting) 法是在混合的復合物中鑒定和定量特定蛋白質的一種有效且常用的方法 (Towbin et al. ,1979)。這一技術對固定在硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯 (PVDP) 膜上的蛋白質樣本進行非直接的檢測。在常規的蛋白質印跡中，蛋白質樣本首先通過 SDS-PAGE 進行分離，然后電轉移到膜上。在用不相關的蛋白質封閉膜之后 ，用與靶抗原結合的一抗 (多克隆抗體或單克隆抗體) 與膜孵育。接著清洗膜，再用可與一抗發生反應的酶聯二抗孵育。然后再次清洗膜，將其在合適的酶底物中孵育。如果使用比色底物的話, 信號可以目測，如果用化學發光和熒光底物，則 可 利 用 X 射線膠片或成像設備測得信號。

蛋白質印跡方法學中幾個最重要的進步包括高靈敏度增強化學發光底物、成像系統和最近出現的多種見光穩定的榮光劑= 超尚靈敏度的化學發光底物 的廣泛應用幾乎取代了同位素標記的探針的使用。用¹²⁵I 標記的蛋白質 A 或蛋白質 G 曾一度廣泛用做二級檢測劑，但如今增強化學發光底物就可檢測到低至飛克 (femtogram) 數量級的蛋白質，并且具有高信噪比。

電荷親合元件 (charged-coupled device，CCD) 成像儀在大多數實驗室中都十分常見。成像儀具有較大動態范圍和高程度曝光控制, 這使得背景信號能夠自由調節。此外 ，成像儀所附帶的分析軟件能夠完成光密度分析。盡 管 X 射線膠片仍然應用廣泛且靈敏度更高，但 是 CCD 成像系統卻可以避免處理膠片和顯影的麻煩，并且也不會產生化學廢物。

近 來 ，熒 光 劑 染 料 發 展 迅 速 ，這 要 歸 功 于 新 一 代 熒 光 團 。與 傳 統 熒 光 團 相 比 ，它 們 在亮 度 、光 穩 定 性 及 p H 靈 敏 度 上 有 著 巨 大 的 進 步 。通 過 熒 光 檢 測 的 蛋 白 質 印 跡 檢 測 法 通常 用 于 同 一 印 跡 中 需 要 檢 測 兩 種 不 同 靶 抗 原 時 。而 突 光 團 對 的 選 擇 基 于 它 們 不 同 的 可 區分 開 的 激 發 -發 射 光 譜 。易 辨 別 的 顏 色 差 異 能 夠 使 多 色 檢 測 實 驗 順 利 完 成 。最 值 得 注 意的 是 ，這 些 新 型 熒 光 染 料 結 合 軟 件 的 運 用 ，可 實 現 細 胞 信 號 通 路 的 檢 測 和 定 量(Chou d h a r y et al ,2007；T i p s m a r k et al. ,2008)

二、蛋白質印跡法的種類

2.1 直 接 與 間 接

直 接 蛋 白 質 印 跡 法 是 指 利 用 標 記 報 告 系 統 的 一 抗 直 接 與 靶 蛋 白 結 合 。間 接 蛋 白 質 印跡 法 則 利 用 標 記 的 二 抗 (R a m L a U ，1987) 與 未 標 記 的 一 抗 相 結 合（圖 33. I h 由 于 無 需 與二 抗 孵 育 ，直 接 蛋 白 質 印 跡 法 比 間 接 蛋 白 質 印 跡 法 耗 時 較 短 。此 外 ，直 接 蛋 白 質 印 跡 法 也避 免 了 因 二 抗 交 叉 反 應 所 造 成 的 背 景 信 號（Bergendahl et al. ,2003)。直 接 蛋 白 質 印 跡法 還 可 同 時 探 測 多 種 靶 物 質 。但 是 有 時 在 免 疫 反 應 中 , 標 記 一 抗 會 有 不 利 影 響 ，并 且 即 便在 最 好 的 情 況 ，標 記 過 的 一 抗 也 無 法 進 行 信 號 放 大 。因 此 ，直 接 蛋 白 質 印 跡 法 的 靈 敏 度 通常 要 低 于 間 接 檢 測 法 ，并 且 只 能 在 靶 抗 原 豐 度 較 高 時 使 用 。能 夠 放 大 信 號 并 不 使 用 二 抗的 間 接 檢 測 法 稱 為 一 抗 生 物 素 化 。用 生 物 素 化 的 試 劑 標 記 一 抗 通 常 使 每 個 抗 體 分 子 帶 有超 過 一 個 生 物 素 。每 一 個 生 物 素 都 能 夠 和 酶 聯 的 親 和 素 、鏈 霉 親 和 素 或 T h e r m o Scientific NeutrAvidin Protein? 發 生 反 應 。這 些 多 酶 體 系 催 化 了 合 適 的 底 物 的 轉 化 ，以 此 放 大信 號 。基 本 上 ，親 和 素 偶 聯 物 替 代 了 二 抗 , 并 且 其 物 質 的 量 濃 度 和 二 抗 原 本 的 物 質 的 量 濃度 幾 乎 相 同 。但 是 需 要 注 意 , 如 果 用 于 凝 膠 中 的 樣 本 是 天 然 生 物 素 化 的 ，尤 其 是 在 使 用 高靈 敏 度 底 物 時 ，產 生 的 信 號 很 有 可 能 會 干 擾 靶 蛋 白 的 檢 測 。

2.2 far-Western

有 時 , 針 對 一 種 特 定 抗 原 的 抗 體 在 蛋 白 質 印 跡 分 析 時 并 不 適 用 ，或 者 無 法 獲 得 。然而當 靶 蛋 白 結 合 物 可 充 當 探 針 時 ，印 跡 法 仍 然 可 行 。這 種 類 型 的 應 用 便 稱 為 far-WestemBlot, 通 常 用 于 蛋 白 質 -蛋 白 質 相 互 作 用 的 發 現 或 確 認 。關 于 這 個 主 題 的 變 化 頗 多 ，并 涉及 前 文 所 述 的 所 有 方 法 策 略 。此 時 標 記 過 的 結 合 物 就 相 當 于 一 抗 , 可 通 過 與 35S 體 外 翻 譯反 應 進 行 標 記 。也 可 以 將 探 針 生 物 素 化 ，并 用 親 和 素 或 類 似 親 和 素 的 偶 聯 物 檢 測 ，這樣能夠 更 好 地 放 大 信 號 。必 須 注 意 探 針 不 宜 過 度 標 記 ，因 為 這 會 減 弱 它 與 靶 物 質 的 反 應 能 力 。或 者 ，可 將 帶 標 記 的 重 組 探 針 在 細 菌 中 表 達 (標 記 可 選 擇 G S T 、H A 、c-M y c 或 F L A G ) ，通過 識 別 這 些 標 簽 的 標 記 抗 體 實 現 檢 測（Burgess et aL ,2000)。

2.3 半定量蛋白質印跡法

通 常 認 為 蛋 白 質 印 跡 法 是 定 性 的 ，但 當 加 入 特 定 對 照 時 ，它 也 可 成 為 一 種 定 量 方 法 。當 E L I S A 無 法 用 于 某 種 樣 本 ，或 是 當 生 物 樣 本 中 的 某 種 組 分 會 干 擾 E L I S A 時 , 半 定 量 蛋白 質 印 跡 法 便 表 現 出 其 優 勢 。一 般 來 說 ，針 對 某 種 蛋 白 質 的 抗 體 也 能 對 與 這 種 蛋 白 質 密切 聯 系 的 蛋 白 質 表 現 出 同 等 專 一 性 。在 這 種 情 況 下 ，E L I S A 會 產 生 假 陽 性 或 過 高 估 計 了
靶 蛋 白 豐 度 。 由 于 蛋 白 質 印 跡 法 需 要 用 凝 膠 電 泳 分 辨 蛋 白 質 ，分 子 質 量 間 的 差 異 可 以 用來 單 獨 區 分 和 定 量 粑 蛋 白（Sato et al. ，2002;Xing and I m a g a w a , 1999)。

為 了 評 估 定 量 蛋 白 質 印 跡 法 的 有 效 性 和 準 確 性 ，我 們 要 用 純 化 的 靶 蛋 白 作 為 內 對 照 ，繪 制 出 標 準 曲 線 。樣 本 必 須 含 有 足 夠 量 的 靶 蛋 白 ，使 其 量 控 制 在 標 準 曲 線 范 圍 之 內 。可借 助 C C D 照 相 機 和 成 像 系 統 對 蛋 白 質 印 跡 進 行 光 密 度 分 析 ，將 條 帶 強 度 轉 化 為 定 量 尺度 。最 后 用 E L I S A 驗 證 蛋 白 質 印 跡 法 測 出 的 曲 線 趨 勢（M a t h r u b u t h a m and V a t t e m ，
2005)。

2.3.1 檢 測 方 法

SuperSignal① W est Dura 底 物（Thermo Fisher Scientific) 檢測信號。用 Kodak 20000 MM成 像 站 成 像 ，并 用 成 像 站 附 帶 的 印 跡 密 度 分 析 軟 件 分 析 蛋 白 質 條 帶 密 度 。定量蛋白質印跡數據可通過 P5 3 和 的 ELISA 實驗進行驗證 (Assay Designs,
Arm Arbor ,M D，根據制造商說明書完成 ELISA。

2.3.2 結 果 及 討 論

蛋 白 質 印 跡 的 光 密 度 分 析 表 明 ，L B a 的 線 性 范 圍 為 0?097? 3.12 n g ，p 5 3 的線性范圍為 1. 87? 60 n g 。在 這 個 范 圍 內 提 供 了 極 佳 的 陽 性 內 對 照 ，并 能 抵 消 蛋 白 質 印 跡 法 效 率的 差 異 。

在蛋白質印跡分析中，在 用 E G F 處 理 后 的 前 5 m in 內 IkBc 1 的水平保持恒定，但在30 min 后迅速降低 3 0 % ，最后, 在接下來的 24 h 內逐漸上升（圖 33.2)。蛋白質印跡光密度分析表明，P5 3 水平在用 D ox 處理后的前 8 h 變化很小，在 這 之 后 的 20?30 h 迅速上升 。若 用 C is 處 理 ，p 5 3 水平則在 30 h 內逐漸上升 (數據未顯示）。

LcBa ( 圖 33.2 ) 和 P5 3 水 平 變 化 趨 勢 可 用 E L IS A 驗 證 ，并 和 已 發 表 的 數 據 一 致(K w ok et a l .，I 9 9 4 5Sun and Carpenter，1998)。在 p53 的實驗 中 ，盡管通過蛋白質印跡法得出的數據已被 ELISA 所驗證，但是，仔細比較這些數據可以發現，在 20?30 h , 蛋白質印跡對 P 5 3 的數量變化更為靈敏。在 20?30 h 存在著大量 P5 3 , 但 是 E L ISA 無法檢測出這段時間中 P 5 3 正在逐漸增加，而蛋白質印跡法卻可以做到。相 反 , 在 前 8 h 內，p 53
水平相對較低，E L IS A 比定量蛋白質印跡法更能較好地檢測 p5 3 的變化。

雖然蛋白質印跡法和 E L IS A 同屬免疫檢測法，但其應用各異, 且通常所用的免疫試劑也有所不同。絕對蛋白質數量差異的產生大抵是因為用于對照組、一抗特異性的重組蛋白有所差異, 以及每種技術中蛋白質的相互作用各不相同。

三、檢測方法

3.1 酶聯物

堿性磷酸酶 (A P，l 4 0 kDa) 作為曾經的首選酶，通常可用做沉淀顯色的底物。比色反應以穩定速率進行，這使相關靈敏度和反應進程能得到精確控制。隨著蛋白質研究的發展 ，H R P(40 kDa) 變得更為流行，因其穩定性好，分子質量更小。這些特性就能使每個Ig G 結合更多的 H R P 分子 ，靈敏度也就更強。此 外 ，用 于 H R P 的化學發光底物還能進一步提 f t 靈敏度。

3.2 比色檢測法

比色或顯色底物或許是最簡便也是最劃算的檢測方法。當與合適的酶接觸時, 這些底物便轉化為不溶的有色物質沉淀在膜上，無 需 特 殊設備便可處理或觀測。底 物 ，如3 ，3’，5，5’-四甲基聯苯胺 (TMB)、4-氯-1-萘酚 (4-CN) 和 3,3’-二氨基聯苯胺鹽酸鹽 (DAB)與 H R P — 同使用。 A P 的底物包括會形成不溶濃紫色沉淀的 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸-P -甲苯胺鹽 (BCIP)、氯化氮藍四唑 (NBT) 和 Fast Red(萘酚 AS-M X 磷酸鹽+ F a s t Red TR鹽）。從不同供應商處購得的同種底物差異可能會很大, 這是因為底物的濃度和純度、添加物及緩沖成分都會影響實驗結果。

3.3 熒光檢測法

借助熒光檢測的蛋白質印跡法通常用于同一印跡中有兩種不同靶物質和需要高靈敏度的實驗中。熒光染料 (通常稱為「熒光團」,即「fluorophore」或簡稱「fluor」) 是一種特殊分 子 ，它在某一波長吸收一個光子能量時化學鍵被激發，回到基態時能發射出一個波長大于吸收光的光子。化學性穩定, 具有合適范圍的高效 (強烈) 激發和發射波長的小分子熒光團可用于檢測抗體的化學標簽或標記，以及其他生物分子探針。

一些基于熒光劑的系統使用熒光蛋白（如藻紅蛋白）或生物發光報告系統，但是這些方法十分耗時，在檢測多種靶物質時具有局限性, 并且通常不具有人工合成熒光染料那樣的 光 穩 定 性 和 靈 敏 度 。利 用 精 選 的 熒 光 染 料 組 所 標 記 的 特 定 探 針 ，熒 光 技 術 實 現 了 多 種靶 物 質 的 探 測 , 并 適 用 于 更 多 型 號 的 熒 光 設 備 。

盡 管 熒 光 黃 、羅 丹 明 和 氨 基 甲 基 香 豆 素 乙 酸 鹽 (A M C A ) 染 料 是 傳 統 的 熒 光 團 ，它們者 IS 具 有 許 多 局 限 性 。特 別 是 這 些 傳 統 染 料 具 有 相 對 較 低 的 熒 光 強 度 ，容 易 發 生 光 漂 白 。新 一 代 的 熒 光 團 克 服 了 這 些 局 限 性 (表 33. 1 ) ，并 且 在 亮 度 、光 穩 定 性 和 p H 靈 敏 度 方 面都 有 巨 大 的 改 進 。這 些 新 型 熒 光 團 可 覆 蓋 整 個 可 見 光 譜 及 大 部 分 的 紅 外 線 光 譜 。

當 進 行 焚 光 蛋 白 質 印 跡 實 驗 時 , 通 常 選 擇 弱 熒 光 (處 理 的 ) 膜 ，因 為 膜 聚 合 物 在 光 譜 可見 范 圍 內 的 自 發 熒 光 會 對 檢 測 造 成 干 擾 。鑒 定 靶 物 質 時 ，選 擇 激 發 -發 射 光 譜 不 重 疊 的 熒光 劑 是 十 分 關 鍵 的 。一對 典 型 的 熒 光 劑 包 括 T h e r m o Scientific Dy L i g h t ① Fluors 549 和T h e r m o Scientific DyLight Fluors 649 或 是 D y Light Near-infrared (I R ) Fluors 680 和DyLight Near-infrared (I R ) FIuots 800。 近 紅 外 線 熒 光 劑 十 分 有 用 ，因 為 蛋 白 質 樣 本 和膜 聚 合 物 的 自 發 熒 光 不 太 可 能 出 現 在 這 些 光 譜 范 圍 中 , 從 而 可 以 實 現 更 低 的 背 景 和 更 高的 靈 敏 度（Patonay and Antoine,1991;Sowell et al. ,2002)。

3.4 化學發光檢測法

最 常 用 的 蛋 白 質 印 跡 法 底 物 是 基 于 魯 米 諾 的 底 物 ，該 底 物 能 夠 產 生 化 學 發 光 信 號 。化 學 發 光 是 一 種 能 夠 產 生 光 形 式 能 量 的 化 學 反 應 (圖 33. 3)。魯 米 諾 在 H R P 和 過 氧 化 氫緩 沖 液 存 在 下 被 氧 化 ，形 成 一 種 處 于 激 發 態 的 產 物 , 從 激 發 態 衰 退 至 基 態 時 能 發 出 光 。光

四、化學發光信號

4.1 信號捕捉

雖然化學發光蛋白質印跡法十分常用，但是對于難于捕獲的信號的捕捉卻很棘手。蛋白質印跡法要用到一系列需要技巧的技術，因此許多因素都會導致無法捕捉到信號。由于變量較多 (表 33. 2)，問題印跡的問題診斷和排除就如同大海撈針一樣困難。傳統的方案在檢測某一個蛋白質時通常都是無效的。例如 ， 一 抗可能無法識別變性狀態下的固定化抗原。盡管在非變性環境下蛋白質可保持天然狀態，但這卻使得目標蛋白質分子質量的確定更具挑戰。此外，超大型或疏水蛋白質通常會阻礙有效的膜轉移。另外，小型蛋白質 (小于等于 10 kDa) 會從膜孔中穿出，無法與膜結合。因此, 為確保能夠用于檢測靶物質，Towbin 的原始方案一再被修改。這些修改包括使用不同的試劑進行間接檢測或 4標記的一抗進行直接檢測。有時可以完全跳過轉移這一步驟，在凝膠內完成檢測（Desaiet al.,2001)。

體 持 續 時 間 取 決 于 所 使 用 的 特 定 底 物 。產 生 了 多 少 光 、這 些 光 能 持 續 多 久 , 則 取 決 于 具 體使 用 的 底 物 以 及 系 統 中 酶 與 底 物 之 間 的 比 例 。盡 管 用 于 一 個 印 跡 的 底 物 量 相 對 恒 定 ，呈現 的 酶 的 數 量 卻 和 添 加 量 以 及 其 他 因 素 有 關 (見 表 33.1)。在 蛋 白 質 印 跡 系 統 中 ，酶 聯 物過 多 是 導 致 信 號 易 變 、背 景 太 深 、信 號 持 續 時 間 短 及 靈 敏 度 低 的 單 一 的 最 主 要 的 原 因 。

最 理 想 的 信 號 發 射 曲 線 是 緩 慢 衰 減 的 (圖 33. 4 ) , 因 為 這 表 明 系 統 中 的 每 一 組 分 都 達到 了 最 優 化 ，并 能 產 生 可 重 復 的 結 果 。信 號 衰 減 的 太 快 會 造 成 差 異 ，使 得 靈 敏 度 低 及 信 號記 錄 不 足 。持 續 時 間 長 的 信 號 能 最 大 限 度 減 小 因 轉 移 效 率 、底 物 制 造 商 批 次 和 其 他 因 素造 成 的 差 異 。

雖 然 H R P 在 底 物 存 在 的 情 況 下 能 保 持 活 性 ，但 是 隨 著 和 底 物 接 觸 時 間 的 延 長 , H R P也 會 失 活 。在 氧 化 反 應 中 產 生 的 自 由 基 可 與 H R P 結 合 ，這 種 方 式 讓 酶 無 法 再 與 底 物 反應 。系 統 中 過 量 的 H R P 也 會 產 生 大 量 的 自 由 基 ，這增 加 了 H R P 失 活 的 可 能 性 。 自由基還 會 破 壞 抗 原 、抗 體 和 膜 ，降 低 膜 再 標 記 的 有 效 性 。

4.3 蛋 白 廣 印 跡 的 優 化

每 一 個 蛋 白 質 印 跡 系 統 都 必 須 經 過 優 化 以 獲 得 一 致 的 實 驗 結 果 。許 多 因 素 都 會 影 響信 號 的 強 度 和 持 續 時 間 , 每 一 種 因 素 都 可 被 優 化 , 我 們 將 在 以 下 幾 節 中 討 論 。本 章 末 尾 關于 方 案 的 一 節 包 括 了 優 化 步 驟 的 具 體 指 導 和 建 議 。

4.3.1 印跡膜

膜 組 分 似 乎 不 能 影 響 H R P -魯 米 諾 反 應 以 及 后 續 的 信 號 產 生 。然 而 ，硝 酸 纖 維 素 膜和 P V D F 膜 的 確 在 蛋 白 質 結 合 特 性 上 有 所 不 同 。一 般 來 說 ，硝 酸 纖 維 素 膜 能 更 好 地 與 蛋白 質 結 合 ，條 帶 更 清 晰 ，有 時 候 靈 敏 度 也 更 高 。而 P V D F 膜 疏 水 性 更 強 , 不 易 浸濕 ，有 時會 產 生 更 多 背 景 信 號 ，然 而 ，它 具 有 較 大 的 抗 張 強 度 和 良 好 的 操 縱 特 性 。為 獲 得 最 好 的 實驗 結 果 ，需 要 根 據 經 驗 來 確 定 蛋 白 質 印 跡 系 統 最 優 化 的 膜 類 型 、制 造 商 和 批 次 。一旦 證 明某 種 膜 在 系 統 中 有 效 ，最 好 在 整 個 研 究 過 程 中 都 使 用 這 一 批 次 的 產 品 。

4.3.2 靶蛋白

不 同 蛋 白 質 的 轉 移 效 率 有 著 很 大 不 同 。在 特 定 的 設 置 的 條 件 下 ，蛋 白 質 遷 出 凝 膠 的能 力 及 結 合 膜 的 向 有 所 不 同 。轉 移 效 率 依 賴 于 一 定 因 素 ，如 凝 膠 組 分 、凝 膠 與 膜 的 接 觸程 度 、電 極 的 位 置 、轉 移 的 持 續 時 間 、蛋 白 質 大 小 和 組 分 、電 場 強 度 及 是 否 加 人 去 污 劑 。低離 子 強 度 緩 沖 液 和 低 電 流 的 條 件 可 使 大 多 數 蛋 白 質 達 到 最 優 轉 移 。使 用 與 免 疫 印 跡 相 兼容 的 或 可 逆 的 染 料 對 膜 進 行 染 色 ，可 評 估 轉 移 效 率 (Sasse and Gallagher, 2008)。用 于 膜染 色 的 一 些 常 見 蛋 白 質 染 料 包 括 : 麗 春 紅 S ,— 種 可 隨 時 間 褪 色 的 紅 色 染 料 ; 考 馬 斯 染 料 ，一 種 可 緊 密 結 合 蛋 白 質 并 干 擾 免 疫 印 跡 的 敏 感 的 藍 色 染 料 ,— 種 簡 單 可 逆 的 藍 色 染 料（Antharavally et al. ，2004)。

4.3.3 封閉緩 沖 液

很 多 不 同 的 封 閉 試 劑 都 對 蛋 白 質 印 跡 有 效 。因 為 沒 有 任 何 一 種 封 閉 劑 適 用 于 所 有 系統 ，故 有 必 要 進 行 檢 驗 (Spinola and C a n n o n ，1985)。理 想 的 封 閉 緩 沖 液 具 有 最 大 的 信 噪比 ，而 且 不 會 與 系 統 中 的 抗 體 或 靶 物 質 反 應 。例 如 , 在 親 和 素 -生 物 素 系 統 中 使 用 5 % 脫脂 牛 奶 作 為 封 閉 劑 可 造 成 高 背 景 ，因 為 牛 奶 中 含 有 不 同 量 的 內 源 生 物 素 , 可 與 親 和 素 蛋 白結 合 。當 變 換 底 物 、抗 體 或 靶 物 質 時 ，僅 僅 因 為 對 于 這 一 新 系 統 封 閉 緩 沖 液 不 再 是 最 理 想的 , 就 可 能 引 起 信 號 減 弱 或 背 景 增 強 。

在 封 閉 緩 沖 液 中 加 人 表 面 活 性 劑 ，如 去 污 劑 T W e e n -20，可 為 某 些 系 統 帶 來 好 處 。表 面 活 性 劑 阻 止 封 閉 試 劑 與 靶 物 質 的 非 特 異 結 合 ，或 將 膜 上 抗 體 可 以 結 合 的 疏 水 位 點 封閉 , 從 而 使 背 景 最 弱 化 。然 而 ，加 入 過 多 的 去 污 劑 會 造 成 封 閉 不 充 分 。通 常 我 們 使 用 終 濃度 為 〇. 0 5 % 的 去 污 劑 。但 是 ，為 了 得 到 最 好 結 果 , 我 們 要 確 定 去 污 劑 是 否 增 強 了 某 個 特殊 系 統 及 確 定 去 污 劑 的 理 想 濃 度 。通 常 使 用 高 質 量 低 污 染 的 去 污 劑 。

4.3.4 抗體

不 只 是 作 用 于 抗 原 的 一 抗 的 親 和 力 很 重 要 , 一 抗 和 二 抗 濃 度 同 樣 對 信 號 強 度 有 很 大影 響 。一 抗 或 /和 二 抗 濃 度 不 當 會 造 成 印 跡 上 H R P 過 多 。采 用 最 小 一 抗 濃 度 比 較 有 利 ，因 為 這 樣 能 推 動 靶 物 質 的 特 殊 結 合 并 降 低 背 景 。

如 果 印 跡 不 能 產 生 足 夠 的 信 號 ，就 將 所 有 的 檢 測 試 劑 從 印 跡 中 移 除 (剝 離），并 使 用 不同 的 一 抗 或 不 同 的 抗 體 濃 度 重 新 標 記 ，這 種 做 法 常 常 可 以 節 約 珍 貴 的 樣 品 ，并 且 節 省 時間 ; 然 而 ，不 充 分 的 剝 離 可 使 有 活 性 的 H R P 殘 留 在 印 跡 上 并 產 生 信 號 。將 底 物 加 在 被 剝離 的 印 跡 上 , 隨 后 便 可 檢 測 出 印 跡 上 是 否 殘 留 活 性 H R P 。 同 樣 , 剝 離 無 法 移 除 的 大 量 失活 H R P 分 子 會 抑 制 一 抗 與 靶 物 質 的 結 合 。剝 離 并 重 新 標 記 印 跡 是 一 種 獲 得 特 殊 系 統 相關 信 息 的 有 效 方 法 ，但 并 不 是 一 種 確 定 理 想 系 統 參 數 的 決 定 性 方 式 。

4.3.5 檢 測 方 法

習 慣 上 ，使 用 膠 片 來 檢 測 蛋 白 質 印 跡 的 化 學 發 光 信 號 。它 不 需 要 昂 貴 的 設 備 ，并 能 提供 極 佳 的 靈 敏 度 ，但 卻 只 有 狹 窄 范 圍 的 線 性 檢 測 強 度 。通 常 需 要 調 整 膠 片 的 曝 光 時 間 以得 到 具 可 出 版 質 量 的 印 跡 結 果 ，這 會 消 耗 時 間 并 造 成 浪 費 。將 曝 光 后 的 膠 片 浸 泡 在Thermo Scientific Reagents 系 列 產 品 中 可 以 移 除 曝 光 過 度 產 生 的 額 外 信 號（圖 33.5 ) 。這 些 試 劑 可 以 均 勻 地 移 除 膠 片 中 的 銀 ，在 優 化 膠 片 表 觀 的 同 時 維 持 信 噪 比 。

C C D 照 相 機 及 附 帶 的 分 析 軟 件 可 以 調 整 背 景 水 平 并 完 成 密 度 測 定 。與 膠 片 相 比 ，成像 儀 在 檢 測 方 面 具 有 一 定 優 勢 ，因 其 有 較 大 的 動 態 范 圍 和 高 程 度 的 曝 光 控 制 ，可 在 沒 有 高背 景 或 高 強 度 信 號 干 擾 數 據 的 情 況 下 盡 可 能 地 完 成 圖 像 記 錄 。此 外 , 理 想 的 曝 光 時 間 可防 止 條 帶 信 號 飽 和 , 并 能 觀 察 到 密 度 的 微 小 變 化 。相 比 較 而 言 ，膠 片 具 有 較 小 的 動 態 范圍 ，條 帶 信 號 也 會 迅 速 達 到 飽 和 。當 信 號 強 度 較 高 時 ，膠 片 的 低 動 態 范 圍 使 其 快 速 飽 和 ，并 且 曝 光 控 制 的 局 限 性 通 常 會 產 生 過 度 曝 光 的 圖 像 。

五、常見問題及其原因

5.1 沒 有 信 號

初 次 曝 光 時 未 捕 獲 到 化 學 發 光 信 號 , 表 明 該 蛋 白 質 印 跡 系 統 需 要 優 化 。通 常 , 信 號 缺失 由 系 統 中 酶 量 (即 HRP) 過 多 造 成 。當 信 號 不 能 被 檢 測 到 時 ，采 用 更 少 量 的 酶 聯 物 似 乎有 違 我 們 的 直 覺 。然 而 ，若 要 得 到 成 功 的 信 號 記 錄 ，酶 和 底 物 量 的 恰 當 平 衡 是 必 要 的 。酶催 化 的 底 物 氧 化 是 不 可 逆 的 ，因 此 , 一 旦 底 物 被 氧 化 , 就 不 能 再 與 酶 反 應 而 發 光 。 因 為 酶活性持續存在，底物就成了限制性因素，并且一旦底物耗盡，信號輸出就終止了。在活性酶量不足的情況下發生信號缺失是很少見的。蛋白質印跡系統中的任何因素都會造成酶量過多或不足。

為了產生能夠被捕獲的信號，需要調整系統參數。制備新凝膠并使用較少樣品或滴定抗體能獲得可重復的結果。當優化抗體濃度時，需要對印跡成像兩次: 第一次在加人底物后立即進行; 第二次在孵育底物一段時間后（如 I h ) 進行。第二次檢測能提供理想酶濃度的相關信息，并有助于優化參數。

并且，如果初次曝光未捕獲到信號，則在底物中進行二次孵育可能會產生信號 (若一些 H R P 仍有活性）。將所有的檢測試劑從印跡中剝離并再標記印跡可以在優化參數的同時節省珍貴的樣品。在底物中進行一次額外的孵育并剝離印跡僅僅只能再次獲取系統的一些相關信息。如果想要了解印跡與印跡之間的一致性和對比性, 就必須在每一次實驗中采用相同的條件和相同的步驟。

5.2 信 號 快 速 消 失

當一個特定系統產生的化學發光信號會快速消失時，需要根據前述方法對蛋白質印跡系統做一些優化。好消息是可以獲得信號，表明此次印跡已經有所優化。有些時候盡管所有的參數都是相同的，但特定系統依然會產生比通常消失得更快的信號。系統全面優化后會將這一類型的結果最小化。原方法經內部的輕微改動，就能得到雖不是最優化但卻也能獲得成功的系統，如轉移效率以及在保存和操作過程中樣品及抗體活性的改變。

5.3 背 景 過 強

產生高背景信號的原因可能是封閉不充分, 抗體與封閉蛋白質發生了交叉反應，或是使用了過量的酶聯物。有時研究人員認為某種特定的底物能產生背景或增強背景。這種底物通常在酶不存在時自身無法產生信號。當使用比先前更為敏感的底物時，如果不調整參數以補償底物靈敏度，就會產生高背景。采用最適濃度的抗體將會促進其對靶蛋白的特異結合并產生低背景。

5.4 新 的 底 物 無 法 產 生 信 號

有時 ，某個特定系統中唯一發生改變的變量為一瓶新的或批號不同的底物時，可能無法捕獲到信號。通常 ，該結果是由尚未完全優化的蛋白質印跡系統造成的。蛋白質印跡的底物本身就是可變的。許多制造商僅僅控制最小靈敏度，這使得新底物可能比先前使用的批次的更加敏感。在全面優化的印跡系統中, 底物敏感度的變化和其他的變量一樣，都是微小或不顯著的。

5.5 膜 上 呈 現 棕 色 或 黃 色 條 帶

當 H R P 被氧化和失活時會呈現棕色。一定量的酶聯物中，總是會有一部分被氧化。在優化后的系統中，被 氧 化 的 H R P 的量極小并無法從印跡上觀察到。黃色或棕色條帶的出現表明有大量的 H R P 存 在 ，因而被氧化和失活的部分是可見的。會產生黃色帶的印 跡 系 統 需 要 通 過 可 采 用 更 少 量 的 酶 聯 物 進 行 優 化 。此 外 ，過 多 H R P 在 某 一 局 部 位置 時 ，則 會 在 酶 活 作 用 下 產 生 大 量 自 由 基 。 自 由 基 會 使 H R P 失 活 ，并 破 壞 抗 體 、靶 抗 原
和 膜 ，抑 制 有 效 的 再 標 記 。

5.6 條 帶 或 整 個 印 跡 在 暗 室 發 光

若 底 物 孵 育 后 的 條 帶 或 整 個 印 跡 發 光 ，可 認 為 系 統 中 存 在 過 多 的 H R P 。該 現 象 表 明H R P 連 接 的 二 抗 需 要 進 一 步 稀 釋 ，并 且 可 能 的 話 一 抗 也 要 稀 釋 。蛋 白 質 印 跡 系 統 中 涉 及的 許 多 因 素 都 可 以 引 起 酶 量 過 多 。若 整 個 印 跡 都 在 發 光 ，那 就 很 有 必 要 對 封 閉 和 清 洗 也進 行 優 化 。

5 .7 假 帶 / 空心帶

那 些 成 暈 輪 狀 (條 帶 中 間 無 信 號 ) 或 黑 色 背 景 下 整 個 條 帶 都 顯 白 色 的 蛋 白 質 條 帶 通 常被 稱 為 假 帶 。 白 色 區 域 內 底 物 耗 盡 時 就 會 導 致 這 一 結 果 的 發 生 。

我 們 并 不 明 確 假 帶 產 生 的 特 殊 原 因 。因 此 ，我 們 檢 測 了 幾 種 能 夠 造 成 這 一 結 果 的 因素 。我 們 會 在 下 面 章 節 中 簡 要 描 述 研 究 結 果 , 下 述 章 節 會 反 映 一 些 常 見 引 起 假 帶 效 果 的原 因 ，包 括 在 凝 膠 中 加 人 了 過 多 的 靶 蛋 白 ，以 及 使 用 了 會 與 封 閉 液 組 分 發 生 交 叉 反 應 的 抗體（V a t t e m and M a t h r u b u t h a m ,2005)。

5.7.1 分析方法

間 的 底 物 孵 育 會 延 長 信 號 持 續 時 間 。使 用 W e s t P i c o 或 W e s t D u r a 底 物 能 檢 測 到 低 至10 n g 的 蛋 白 質 , 甚 至 在 完 成 蛋 白 質 印 跡 的 64 h 后 依 然 可 以 檢 測 到 信 號 。 W e s t D u r a 比W est P ic o 的 底 物 更 敏 感 和 持 久 。盡 管 W e s t D u r a 在 檢 測 5 n g 蛋 白 質 時 能 產 生 極 強 信號, 但泳道中含量超過 100 n g 會 導 致 信 號 迅 速 消 失 ，這 強 調 了 局 靈 敏 度 檢 測 系 統 下 米 用適 量 靶 蛋 白 的 重 要 性 。

通 常 用 脫 脂 牛 奶 溶 液 孵 育 印 跡 以 最 小 化 背 景 信 號 。改 變 封 閉 液 中 牛 奶 的 濃 度 不 會 產生 假 帶 。 令 人 吃 驚 的 是 ，封 閉 液 中 含 0 . 5 % 脫 脂 牛 奶 可 以 增 強 低 豐 度 蛋 白 質 的 檢 測(圖 33. 7A ); 然 而 ，抗 體 同 封 閉 蛋 白 質 的 交 叉 反 應 確 實 會 引 起 假 帶 。如 果 一 抗 或 二 抗 同牛 奶 蛋 白 質 相 結 合 ，這 些 封 閉 的 位 點 化 學 發 光 ，產 生 深 色 背 景 ，而 樣 品 蛋 白 質 集 中 于 膜 表面 ，形 成 白 色 條 帶 (圖 33. 7B )。

高 濃 度 的 酶 聯 二 抗 與 大 量 靶 蛋 白 結 合 時 會 增 強 底 物 的 催 化 作 用 ，從 而 導 致 信 號 迅 速消 失 ，使 這 些 區 域 內 的 底 物 迅 速 耗 盡 。膜 上 轉 移 的 大 量 蛋 白 質 可 與 大 量 H R P 連 接 的 二抗 相 結 合 。這 些 免 疫 復 合 物 集 中 區 域 內 產 物（也 就 是 信 號）的 過 度 產 生 會 使 底 物 迅 速 耗盡 ，造 成 假 帶 。總 之 ，凝 膠 過 量 上 樣 、二 抗 濃 度 過 高 、底 物 孵 育 未 達 到 最 優 化 的 時 間 ，以及抗 體 與 封 閉 區 的 交 叉 反 應 均 可 引 起 假 帶 。在 使 用 髙 靈 敏 度 檢 測 系 統 時 ，優 化 蛋 白 質 印 跡參 數 對 于 防 止 假 帶 的 產 生 是 極 其 至 關 重 要 的

六、使用化學發光底物的印跡法和操作規程的優化

6.1 使 用 化 學 發 光 底 物 的 蛋 白 質 印 跡 法

(1) 凝膠電泳分離蛋白質樣品。

(2) 制備轉移緩沖液。采 用 4 〇 0 m L 超 純 水 制 備 Tris— 甘氨酸轉移緩沖液，再加人IOOmL 甲醇。 4°C 下 使 用 和 保 存 該 轉 移 緩 沖 液 。注 ： 轉 移 緩 沖 液 ： 25 mm 〇 I/LTris、192 mmol,L 甘氨酸 (pH8_ 0),2 0 % 甲醇。

(3) 為濕轉移制作凝膠「三明治」(圖 33.8)。對于半干的轉移，在陰極和陽極間按同樣的步驟制作三明治。， : 在三明治裝配前將襯墊和濾紙浸泡在轉移緩沖液中。

⑷將蛋白質從滅膠轉移到膜上。濕轉移時如果使用為 g cmX1 〇 c m 凝設計的迷你轉移裝置，則 40 V 轉 移 90min, 并保持緩沖液溫度為4 ℃ 。半干型轉移時,15 v 轉移90 min。注: 通過凝膠染色或膜可逆染色來確定轉移是否成功。

(5) 取下膜』 在封閉緩沖液中室溫 (R T ) 搖晃孵育 2 〇?60 min ，以封閉膜上的非特異結合位點。

(6) 用 含 1 0 % 封閉液的一抗溶液孵育膜并振搖丄 h 。如果需要的話將印跡在 2?8℃過夜孵育。

(7) 清洗 膜 3 次 ，每 次 5 min』 可 用 Tris-鹽緩沖液 (TBS)、磷酸鹽緩沖液 (pBS 域 其 他

(9) 清 洗 膜 5 次 ，每 次 5 m in 以除去未能結合的酶聯物。酶聯物孵育后徹底清洗膜是至關重要的。

(10) 制備底物。使用足量底物以確保膜完全浸濕 (0.1 mL/cm2), 且膜不能變干。

(11) 用電化學發光 (ECL) 孵 育 膜 I m in, 或 使 用 SuperSignal 底物孵育 5 m in。

(12) 將膜從底物中移出并放置在塑料片保護器內。盡管塑料保鮮膜也能起作用，但是硬質的塑料片做成的保護器作用更好。移除所有在膜和膜保護器表面之間的氣泡。

(13) 通過膠片或冷 CCD 照相機進行印跡成像。

6.2 蛋白質印跡去除方案

采 用 化 學 發 光 底 物 的 眾 多 好 處 之 一 個 就 是 能 夠 移 除 所 有 檢 測 試 劑（Kaufmannet al.,1087)。這些移除方法對于沉淀底物是無效的，并且用于熒光染料顯色的膜時結果各異。

(1) 制備蛋白質印跡膜剝離液。使用下述剝離液中的一種：

① Restore W estern Blot Stripping Buffer(Therm o Fisher Scientific 公司產品）

② 0?I m o l / L 甘氨酸- H C K p H 2. 5?3. 0);