液相色譜儀液體樣品預處理技術液液萃取步驟及應用

 一、液-液萃取

液-液萃取是最常用的液體樣品萃取技術之一。液-液萃取常涉及互不相溶的兩相溶劑,利用待測物在兩相中具有不同的分配系數而達到分離的目的。在液-液萃取操作過程中一相通常為水相,而另一相為有機溶劑。親水性強的化合物進入極性的水相多,而疏水化合物將主要溶于有機溶劑中。萃取進入有機相的被測物經溶劑揮發容易回收,而提取進入水相中的被測物經常能夠直接注入反相HPLC色譜柱中分析。圖1概括了LLE分離所包含的步驟。

圖1 液液萃取步驟框圖

由于萃取為一平衡過程,效率有限,兩相中仍存在數量可觀的被測物。因此可利用包括改變pH值、離子對、配位作用等的化學平衡,以提高被測物的回收率,和/或消除干擾。

液-液萃取中采用的有機溶劑有下列特點:

①在水中溶解度低(<10%);

②具有揮發性,萃取后易于除去與濃縮;

③與用于被測物的HPLC檢測技術相容(避免使用UV吸收強的溶劑);

④極性并可形成氫鍵,提高有機相中被測物的回收率;

⑤純度高,盡量減少樣品污染。

能斯特(Nernst)分配定律說明任何種類溶質在兩不互溶的溶劑中都有分配,而且其在兩相中的濃度比例維持恒定:

(1)

其中,K_D為分配常數;C_o為被測物在有機相中的濃度;C_aq為被測物在水相中的濃度。這樣被測物被萃取進有機相的分數為:

 (2)

其中,V_o為有機相的體積;V_aq為水相的體積;Φ為兩相體積的比值(V_o/V_aq)。許多液液萃取操作在分液漏斗中進行,每一相的體積一般都需幾十或幾百毫升。采用一步提取,由于相比值Φ必須保持在一實際范圍內[如0.1<Φ<10見式(2)],K_D對定量回收兩相之一中的被測物必須足夠大(例如K_D>10)。在大多數分液漏斗液液萃取操作中,定量回收率(>99%)需要兩步或多步萃取。對多步萃取,合并每步萃取得到的被測物的總分數E為:

(3)

其中,n為萃取次數。例如某被測物的K_D=5,兩相的體積相等(Φ=1),被測回收率>99%,則需要分三步萃取。增大K_D可以采用以下幾種方法:

①改換有機溶劑,以使K_D增大;

②如被測物是離子或可電離,通過抑制其離子化,可加大其在有機相中的溶解度,即增大K_D;假如被測物可電離,也可在有機相中添加離子對試劑,被測物與其結合形成離子對被萃取進有機相;

③可在水相中加入一種惰性的中性鹽(例如硫酸鈉),用鹽析法降低被測物在水相中的濃度。

表1列出了一些典型的萃取溶劑以及不適于用作萃取(與水混溶的)溶劑的示例。除考慮互溶性外,溶劑極性以及與被測物極性的關系是主要的選擇標準,當萃取溶劑的極性與被測物匹配時,其K_D值最大,一般需要選擇K值最大的操作條件。 

表1 液-液萃取的提取溶劑

注:第一欄中的溶劑可與第二欄的任一溶劑相匹配;與水混溶的有機溶劑不可與水溶劑一起用于LLE。

如果被測物的K_D不適宜,可能需另外的萃取方法提高回收率[見式(3)]。這種情況下,在原樣品中重新加入不混溶的溶劑,提取剩余的溶質,最后合并所有的提取液。一般來說,最終提取溶劑的體積一定時,多次萃取比單次萃取的溶質回收率高。也可以用反提法進一步減少干擾物。例如,還是考慮上述有機酸被測物的提取。假如被測物首先在低pH值條件下萃取進入有機相,極性干擾物(如親水中性物、質子化堿)被留在水相中。如果用高pH值的新的水緩沖液反提有機相,則離子化有機酸重新轉移到水相中,而將非極性的干擾物留于有機相中。于是分兩步提取不僅能除去堿性干擾物也能夠除去中性干擾物,而一步提取儀能除去這兩種干擾物中的一種,不能把兩種全除去。

如果K_D非常低或所需樣品的體積很大,用多步提取定量回收被測物將不實用,萃取的次數太多,萃取液的總體積可能過大[見式(3)]。而且,萃取率低,達到平衡需較長的時間。此時可采用連續液-液萃取方法,新溶劑連續不斷地循環通過樣品水溶液,被測物連續從樣品液中提出,直至所有的被測物都從樣品中提取干凈。這些提取過程可長時間地運行(12-24h);甚至K_D很小時,也能達到定量萃取要求(回收率>99%)。

在液-液萃取操作過程中經常會碰到樣品發生乳化、被測物牢固地吸附于微粒上、被測物與大分子量的化合物結合(如藥物與蛋白質)、兩相彼此互溶等問題。針對這些問題,可采用下述方法來解決。

①對于發生乳化問題,如果不破乳,水相與有機相之間會出現清晰的界面,被測物回收率會受到很大影響,可以采取在水相中加鹽、加熱或冷卻萃取容器、用玻璃棉塞濾過,用相分離濾紙濾過、加少量不同的有機溶劑或者離心的方法來解決。

②如樣品中有微粒存在,被測物吸附在微粒上可導致回收率降低。這種情況下,濾過之后用強溶劑洗滌微粒以回收被吸附的被測物,并將洗液合并入LLE的被測物相中回收吸附被測物的強溶劑可能包括改變pH值、增加離子強度,或用極性更強的有機溶劑。

③處理生物樣品時,在液-液萃取中能正常定量回收的化合物可能會與蛋白質結合,回收率下降。蛋白結合在測定體液中的藥物與藥物代謝物時尤其棘手。可以采用加入洗滌劑、有機溶劑、離液序列高的試劑或強酸,加水稀釋,以結合更強的競爭試劑替代等方法破壞樣品中蛋白與被測物的結合。

④在不互溶的溶劑之間有很小的溶解度,其中互溶的部分可改變兩相的相對體積,因此可將各相用另一相預先飽和,以便了解含有被測物相的真實體積,準確、優化測定被測物的回收率。最簡單的飽和手段是在分液漏斗中先不加入樣品,使兩相達到平衡,此時兩相相互飽和,均可用于液液萃取。

另外對液-液萃取來說,有機溶劑消耗量大、環境污染較為嚴重。因而,液相微萃取應運而生,集萃取、凈化、濃縮、預分離于一體,具有萃取效率高、消耗有機溶劑少、快速、靈敏的特點,采用這種萃取可以很方便地在容量瓶中進行。選擇密度小于水的有機提取溶劑,以便使小體積的有機溶劑聚集在瓶頸處,方便傾出。對定量分析來說,應該使用內標,以對提取結果加以校正。