cDNA文庫構建技術cDNA鏈的反轉合成

實驗概要

構建cDNA文庫是一種獲得目標基因并進一步進行基因重組，基因克隆的重要方法，而在該文庫構建中有mRNA 逆轉錄出cDNA是一步極為關鍵的操作。mRNA的逆轉錄主要由MMLV、AMV兩種逆轉錄酶催化合成cDNA，在這個逆轉錄過程中，模板mRAN及逆轉錄酶是兩個最重要的影響因素。對于mRNA來講，一是豐度，二是純度，豐度愈高，純度越好，合成效率越好。在逆轉錄酶作用下，以Oligo(dT)或寡聚６核苷酸(隨機)為引物，進行cDNA第一鏈的合成。而第二鏈的合成有自身引物合成，外加引物合成及置換合成，本實驗采用置換合成法進行，即在RNaseH作用下，部分降解RNA，再用DNA多聚酶Ⅰ產生的DNA片段取代，以合成第二條鏈。

實驗原理

主要試劑

cDNA合成試劑盒、飽和酚、氯仿/異丙醇、EDTA、乙醇、3M NaAC pH 5.2、TE緩沖液

主要設備

恒溫水浴，離心機、電泳儀、電泳槽、紫外觀測儀

實驗步驟

1. 第一鏈的合成：

   1) 在滅菌的DEPC處理Eppondef管中，分別加入:                    

         模板              樣品mRNA 1μg 

         引物 (0.5μg/μl)           1μl  （6堿基隨機引物 或oligdt）

         加水至                      10μl

   2) 70℃5-10分鐘，冰浴冷卻5分鐘。

   3) 在上管中，根據下表依次序分別加入

         5×第一鏈緩沖液          4μl

         核酶抑制劑               40μ

         40mM焦磷酸鈉             2μl

         AMV反轉錄酶              20 μ

         加水至                   20μl

   4) 敲打混合，離心后放于37℃或42℃60分鐘。

   5) 反應完畢后，將反應管置于冰浴。用于第二鏈合成。

注：引物可為特異引物（構建特異文庫）、olig0(dt)15引物或6核苷酸隨機引物，但不同引物RT時溫度不同，前兩種在42℃下進行，而隨機引物則在37℃下進行。

2. 第二鏈的合成

   1) 第一鏈合成完畢后，直接進行第二鏈的合成。在第一鏈合成體系中分別加入

          2.5×第二鏈緩沖液          40μl，

                DNA聚合酶Ⅰ          23μ

                    RNase H           0.8μ

                     加水至           100μl

   2) 14-16℃下放置2小時。(>3Kb時反應時間延長至3-4小時)。

   3) 70℃，10min，點動離心，置于冰浴。

   4) 在樣品管中加入T4DNA聚合酶2ul，37放置１0分鐘。

   5) 加入 4μl 500mM的EDTA到該樣品管中，然后置于冰浴上。

   6) 等體積加入酚\氯仿\異戊醇抽上清，12000g，3min。

   7) 上清液轉移至一干凈試管，加2V乙醇，1/10V乙酸鈉，-20℃30min沉淀，12000g，15min收集沉淀，70%乙醇洗沉淀，干燥，TE復溶。

合成后的cDNA鏈既可經與一定的通用接頭連接后，生成末端序列，也可通過一定的內切酶處理，形成一定序列的末端片斷，然后（1）與未端有互補序列的λ臂-DNA連接，形成重組λ-DNA，再經體外包裝形成完整λ噬菌體，經轉染后，生成噬菌體cDNA文庫.（2）與未端有互補序列的質粒載體連接，形成重組質粒DNA，生成質粒cDNA文庫。目前經常使用的一些載體已經商品化，商品化的λ載體主要有噬菌體左右臂、復制原點及啟動序列構成，其在連接酶作用下，可直接于具相同末端序列的cDNA互補連接。cDNA末端序列的產生可通過1)可添加核苷酸后酶切；2)直接加商品接頭而形成與相應噬菌體左右臂相互補的序列。不同載體有不同的末端序列，有不同的宿主菌，有不同的篩選方式，因此在進行文庫包裝時，一定要搞清楚這些情況，以有的放矢的進行工作。

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