cDNA鏈的連接、包裝及轉染

實驗概要

本實驗介紹了構建cDNA文庫中的cDNA鏈的連接、包裝及轉染流程。

主要試劑

EcoRⅠ連接子試劑盒

主要設備

恒溫水浴，離心機、電泳儀、電泳槽、紫外觀測儀

實驗步驟

1. cDNA加接頭反應

   1) 按下表準備反應體系

                 10×緩沖液T4DNA連接酶  3μl

                 BSA                      3μl

                 cDNA                    2.5μl

                連接子                   1μl

               T4DNA連接酶               1μl

               加水至                   30μl

   2) 15℃保溫6-18小時。

   3) 70℃加熱10分鐘后放置于冰浴。

2. 磷酸化反應

   1) 按下表準備反應體系

            上述1.a反應物        30μl

            T4磷酸激酶10×緩沖液 4μl

            0.1mM ATP              2μl

            T4激酶(10μ/μl)      1μl

            水                    3μl

            總體積               40μl

   2) 37℃保溫30分鐘。用DNA純化柱純化帶接頭的cDNA。

   3) 用1ml Sephacryl S-400裝柱，TEN緩沖液平衡拄，平衡液流干后，加套管，800g5min。

   4) 上樣，用1mlTEN緩沖液洗柱2次，收集洗脫液。洗脫時加套管，800g5min。

   5) 合并洗脫液。

   6) 3M NaAC和無水乙醇沉淀，干燥復溶。

3. cDNA與載體聯接：

   1) 準備4個離心管，按下表加入

                                                           A   B   C   D

             載體DNA0.5ug/ul)                        2

             cDNA(10ng/ul)                      0    3  2   1

            10×T4DNA連接酶緩沖液            1

            水                                            6    3   4   5

            T4DNA連接酶                                  1

   2) 保溫，室溫:3小時;4℃過夜。

4. 體外包裝：

   1) 從－70℃取出包裝蛋白，冰浴中溶化，每管50ul。

   2) 包裝蛋白混合液完全溶化后，立即加入10ul“3.a”中的連接液，輕彈管壁，輕輕混勻。

   3) 22℃（室溫）放置3小時。

   4) 上述包裝混合液中加入445ul的phage緩沖液和25ul氯仿，輕輕混勻，冰浴保存。（包裝液4℃下可存放7天）。

5. 感染

   1) 滅菌培養皿中倒入下層LB培養基，凝固后，37℃保溫。

   2) 安1：1000的比例稀釋“4”中的包裝混合液。

   3) 取100ul稀釋液和100ul菌株（Y1090、LE392）。

   4) 取4ml熔化45℃保溫的上層培養基加入到“c”中的混合液中，混勻后鋪板在37℃預熱的下層培養基上，37℃過夜。

6. 收集和擴增文庫

構建的cDNA文庫經擴增后，才能保存和進行長期篩選。本文庫由λgt11作為載體而構成，因此擴增時應在大腸桿菌Y1090中進行。

   1) 過夜后的皿上挑取出現的噬菌斑，加2－3mlSM緩沖液，室溫震蕩２小時。４℃7000g離心30min，以除去細胞碎片，分裝上清，溶解噬菌斑，4℃8000－10000g快速離心10min，以除去細胞碎片和培養基成分。

   2) 重復上步操作。

   3) 上清液轉入一新管 中，如要在4℃短期保存則按１ml上清中加入20-30μl的比例加入氯仿，4℃保存；如要長期保存則應加入終濃度為７％的二甲基亞砜，于－70℃保存。以被需要時重新涂板篩選文庫。