在用 oligo (dT) 引物構建的 cDNA 文庫中，偶而發生部分 cDNA 克隆缺失了與靶 mRNA 3' 末端互補的序列。這部分序列到底是在 cDNA 合成過程中還是在分子克隆中怎樣缺失和在哪個環節中缺失的尚不清楚。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 在用 oligo (dT) 引物構建的 cDNA 文庫中，偶而發生部分 cDNA 克隆缺失了與靶 mRNA 3' 末端互補的序列。這部分序列到底是在 cDNA 合成過程中還是在分子克隆中怎樣缺失和在哪個環節中缺失的尚不清楚。第一鏈 cDNA 的隨機斷裂，在合成第二鏈 cDNA 過程中 DNA 聚合酶不能抵達模板鏈的末端，引導序列內部的 poly (A) 序列或在分子克隆過程中 poly (dA:dT) 序列附近的 3' 序列的缺失等都是可能造成 3' 末端序列缺失的原因。在用隨機六核苷酸引物構建的 cDNA 基因文庫中，也存在部分的 cDNA 克隆缺失了 3' 末端序列，這是因為這種隨機引物能與靶 mRNA 的許多位點復性結合所致。 |
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| 實驗材料 | 反轉錄酶反轉錄酶緩沖液熱穩定 DNA 聚合酶接頭引物基因特異性反義寡核苷酸引物總 RNA |
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| 試劑、試劑盒 | 擴增緩沖液氯仿dNTP 貯存液胎盤 RNase 抑制劑TE |
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| 儀器、耗材 | 瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠屏蔽型槍頭微量離心管正向排液式移液器PCR 儀水浴箱 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液與溶液
10X 擴增緩沖液
氯仿
4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L，pH 8.0)
胎盤 RNase 抑制劑（20 單位/μl）
TE ( pH 7.6)
2. 酶與緩沖液
反轉錄酶（RNA 依賴的 DNA 聚合酶）
5X 反轉錄酶緩沖液
熱穩定 DNA 聚合酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠
4. 核苷酸與寡核苷酸
接頭引物（10 μmol/L, 5' GACTCGAGTCGACATCG3' ) 溶于水中（10 pmol/μl）
（接頭引物可以與基因特異性正向引物聯合在一起用于擴增特異性靶 cDNA。第一步 PCR 擴增后，PCR 目的產物可能僅占總 DNA 產物的 1%，也可能多至占總 DNA 產物的 100%。如果必要，可用第一輪 PCR 產物作模板進行第二輪嵌套式 PCR，改善目的產物的產率，該輪 PCR 的引物為接頭引物與另一個基因特異性正向引物。在第二輪嵌套式 PCR 擴增后，幾乎所有的擴增產物在 EB 染色下呈現了靶 mRNA 的 5' 區域序列相一致的條帶。
RT-PCR 的引物用自動 DNA 合成儀合成，用于標準 RT-PCR的引物一般不需要進一步純化。然而，如果寡核苷酸引物經商品化的樹脂進行柱層析純化（如 NENLife- Science 公司產品 NENSORB)或者經變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，純化后的引物用于擴增低豐度的 mRNA 時常常會更有效。）
（dT)17-接頭引物（10 μmol/L，5'GACTCGAGTCGACATCGA(T)173'）溶于水中（10 pmol/μl)
基因特異性反義寡核苷酸引物（10 μmol/L) 溶于水（10 pmol/μl）。
（基因特異性反義寡核苷酸引物應該與靶 mRNA 的已知序列互補，其長度在 20~ 30 bp，內含的 4 種堿基數量基本相等，G 與 C堿基的平衡分布以及引物具有較低的自發形成穩定二級結構的傾向。）
總 RNA（100 μg/ml）或 poly (A)+ RNA（10 μg/ml）溶于水中
（總 RNA一般用離液劑（chaotropic agents) 從細胞中抽提的，選擇總 RNA 作模板一般適用于從中等程度到高豐度 mRNA 中通過 RT-PCR 克隆靶基因。對于低豐度靶 mRNA 的樣品最好選擇 poly (A) + RNA 作模板進行 RT-PCR。運用作為 RT-PCR 模板的 RNA 也可以從如下的少量培養細胞中制備。）
5. 特殊設備
自動微量移液器的屏蔽型槍頭
微量離心管（0.5 ml，薄壁擴增反應專用離心管）或微量滴定板
正向排液式移液器
PCR 儀
水浴箱預設水溫在 75℃
二、方法
反轉錄
在實驗開始時，首先要確定 3'-RACE 是否成功。如果反轉錄步驟是有效的，那么分離到含有靶 mRNA 的 3' 末端序列的克隆的幾率是高的。另一方面，如果反轉錄步驟是無效的，那么本方案的后續步驟是無法彌補的。因此，對于反轉錄反應條件是值得花時間優化的，如最佳的引物與模板比例，改變反應體系 Mg2+ 濃度，尋找最適的 Mg2+ 濃度。
1. 轉染 1 pg 至 100 ng 的 poly （A）+ RNA 或 1 μg 總 RNA 到一只新的離心管。用水調整體積至 10 μl。將 RNA 樣品在 75℃ 變性 5 min，將離心管迅速插入冰中冷卻。
2. 向含有這種變性的 RNA 樣品的離心管內依次加入如下試劑：
5X 反轉錄酶緩沖液 10 μl
20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液 1.5 μl
10 μmol/L (dT)17-接頭引物（80 pmol） 8 μl
約 20 單位/μl 胎盤 RNase 抑制劑 1 μl
100~200 單位/μl 反轉錄酶 1 μl
H2O 補足至 50 μl
反應管溫育在 37℃ 反應 60 min。設置 3 支陰性對照管。在一支對照管中加入合成第一鏈 cDNA 反應所需的所有試劑，但不加模板 RNA；第二支對照管加入除了反轉錄酶外的所有試劑；第三支對照管中加入除引物外的所有試劑。這些對照管進行所有的后續步驟。設置這些對照管能保證 cDNA 產物的不是由于污染或由 RNA 的自身引導所致。
3. 用 TE ( pH 7.6 ) 將反轉錄反應產物（cDNA ) 稀釋至終體積為 1 ml。
擴增
4. 按以下次序，將各成分加入到一只 0.5 ml 滅菌離心管、擴增管或滅菌微量滴定板的孔內，建立 PCR 系列反應管：
已稀釋 cDNA 0~20 μl
10X 擴增緩沖液 5 μl
20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液 5 μl
10 μmol/L (dT)17-接頭引物（16 pmol） 1.6 μl
10 μmol/L 接頭引物（32 pmol） 3.2 μl
10 μmol/L 基因特異性正義寡聚核苷酸引物（32 pmol） 3.2 μl
1~2 單位熱穩定 DNA 聚合酶 1 μl
H2O 補足至 50 μl
如果實驗必要，可建立系列的擴增試驗管，用于篩選 cDNA 產生最大量的 3' 末端擴增產物的試驗管。對照管加入以上除了 cDNA 模板之外的所有試劑，以鑒別模板有無污染。
5. 如果 PCR 儀沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴礦物油（約 50 μl），防止樣品在 PCR 反應多個加熱與冷卻的循環過程中蒸發；如果應用熱啟動 PCR 程序， 在反應混合液上層加一滴石蠟油；放置離心管或微量滴定板在 PCR 儀上。擴增核苷酸的典型程序有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：
6. 抽取每種擴增樣品 5~10 μl，用瓊脂凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析擴增結果，用判斷擴增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠）或 SYBR 金顆粒染色后來觀察擴增的量與片段大小。
7. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內樣品液體的上層，反應結束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。
8. 從擴增的 DNA 產物中分離掉殘余的熱穩定 DNA 聚合酶和 dNTP。 |
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