mRNA的分離操作和技巧

與rRNA和tRNA不同的是，哺乳動物細胞的絕大部分mRNA在其3'端均有一 poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纖維素親和層析法從大量的細胞RNA中分離mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在構建cDNA文庫時， 必須經上述純化步驟制備mRNA模板。

進行Northern雜交或Sl 核酸酶作用圖分析時，與總RNA相比，采用poly(A)+ RNA能獲得更為滿意的結果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制備Oligo(dT)－纖維素，也可以買現成的產品。

1）用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纖維素。

2）將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱或裝入填有經用DEPC處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積滅菌水沖洗柱床。柱床體積為1m的oligo(dT)－纖維素最大量為10mg總RNA，如果總RNA的量較少，則應減少oligo(dT)－纖維素的使用量以防止poly(A)+RNA在過柱以及后續步驟中損失。

3）用無菌的1x層析柱加樣緩沖液沖洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x層析柱加樣緩沖液
20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
0.5mol/L NaCl
1mmol/L EDTA(pH8.0)
0.1％SDS
可按以下方法制備滅菌的層析柱加樣緩沖液；將適量無 RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化鈉和EDTA貯存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高壓下蒸氣滅菌，待其次序卻至65℃左右時加入已在 65℃預熱30分鐘的10 ％SDS貯存液。也可以用0.05mol/L檸檬酸鈉代替Tris.Cl 然后用DEPC處理檸檬鈉－NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。

4）用滅菌水溶解RNA，于65℃溫育5分鐘后使迅速冷卻至室溫，加等體積的2x層析柱加樣緩沖液，上樣，立即用滅菌的試管收集洗液。 當所的RNA溶液均進入柱床后，加1倍體積的1x層析柱加樣 ，繼續收集洗出液。加熱RNA可以破壞可能涉及poly(A)尾的二級結構。

5）當全部溶液流出后，將收集液置于65℃溫育5分鐘，重新上樣，并收集流出液。

6）用5-10倍柱床體積的1x層析柱加樣緩沖液洗柱，分部收集洗出液，測定每一收集管的OD260。最補由于不帶poly)A)的RNA洗過柱床， OD260會很高，后來OD260值則很小或為零。在某些方案中，上述步驟后還用5倍柱術體積的含0.1mol/L NaCl的1x 層析柱加樣緩沖液洗柱床，然而由于洗出的不帶poly(A)的RNA很少甚至沒有， 因此這一步驟可以省略。

7）用2－3倍柱床體積的經滅菌且無RNA酶的洗脫緩沖液洗脫mRNA，以1/3－1/2柱床體積分部收集洗脫液。洗脫緩沖液
10mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
0.05％SDS
用于配制洗脫緩沖液的Tris. Cl 和EDTA貯存液應為新近高壓的溶液 可用適量的滅菌水稀釋上述貯存液配制洗脫緩沖液。洗脫緩沖液不能高壓處理，因高壓會使溶產生大量氣泡。

8）收集液置于透明的小溶器內，測定OD260， 使用前比色杯須用濃鹽酸：甲醇（1：1）浸泡1小時，再用經DEPC處理并高壓處理過的水徹底沖洗合并含有RNA的洗脫組分。經上述一輪 oligo(dT)－纖維素親和量層析后得到的RNA中，帶與不帶poly(A)的RNA，其含量近乎相等。如欲進一步純化mRNA，可將洗脫液于65 ℃溫育3分鐘，迅速冷卻至室溫，加入NaCl至終濃度為0.5mol/L，用同一oligo(dT)纖維素柱進行第二輪層析。

9）收集 oligo(dT)－纖維素柱層析的洗脫液，在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終深度為0.3mol/L并混勻。加2.5 倍體積用冰預冷的乙醇，混勻，冰浴至少30分鐘。

10）于4℃以10 000g離心15分鐘回收poly(A)+RNA，小心棄去上清液，用70 ％乙醇洗滌沉淀（通常看不見沉淀），離心片刻，在空氣中晾干核酸沉淀。

11）用少量水重溶RNA，置于比色杯內，測定OD260， 使用前比色杯須用濃鹽酸：甲醇（1：1）浸泡1小時，再用經DEPC處理并高壓處理過的水徹底沖洗。

12）將mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯離心管內，加3倍體積乙醇， 混勻，于－70℃保存備用。回收RNA時，只需取出一小份貯存液，加3mol/K乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L， 混勻，用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。
i.OD260＝1的溶液其RNA含量約為40μg/ml.
ii.從 107個哺乳動物培養細胞中可獲得1－5μg mRNA，所得mRNA通常只占上柱的總RNA的1－2％。