smFRET檢測GPCR調控下游蛋白arrestin的構象分布研究獲進展

　　G蛋白偶聯受體（GPCR）是目前已知的人類基因組中最大的膜蛋白家族，約30%的臨床處方藥的直接靶點是GPCR，負責80%左右的跨膜信號轉導，參與調控人體中多數病理與生理過程。GPCR主要通過G蛋白及arrestin將細胞外的刺激轉變為細胞內信號。近年來，結構生物學研究方法的進步為研究GPCR及其下游蛋白arrestin和G蛋白的功能奠定了良好的基礎。目前，研究GPCR及下游蛋白結構的常用方法主要有晶體學、NMR、冷凍電鏡。然而，通過晶體或電鏡結構獲得的信息，對于GPCR結構和功能的理解往往只能從靜態水平出發，較難捕獲GPCR構象動態轉換的動力學過程以及與下游蛋白相互作用時的瞬時調節過程。NMR 光譜可捕獲GPCR及其下游蛋白的動態過程，卻不能檢測其構象狀態分布。

　　前期工作中，山東大學教授孫金鵬與中國科學院生物物理研究所教授王江云研究團隊，針對受體與arrestin相互作用的磷酸化編碼機制展開了研究工作，發現了GPCR磷酸化編碼機制，提出了受體磷酸化的“笛子模型”理論【Nature Communications 6, 8202 (2015)】。基于“笛子模型”的理論基礎，該合作團隊進一步揭示了GPCR磷酸化編碼別構調控SH3 domain蛋白的多聚脯氨酸碼頭分選機制【Nature Chemical Biology 14, 876-886 (2018)】。近日，該合作團隊結合晶體學、DeSiPher和BRET等技術手段，檢測了GPCR單個磷酸化位點缺陷可引起arrestin遠端功能結構域產生不同的構象變化，并發現了其與arrestin生物學功能的相關性【Nature Communications 12, 2396 (2021)】。

　　為捕獲GPCR調控下游蛋白arrestin的構象狀態分布，王江云團隊、孫金鵬團隊，以及清華大學教授陳春來團隊合作，在Chemical Science上在線發表了研究論文Single-molecule FRET and conformational analysis of β-arrestin-1 through genetic code expansion and Se-Click reaction。科研團隊利用基因密碼擴展技術選擇特異性的將非天然氨基酸SeF插入到arrestin的特定位點，然后將熒光染料Bodipy593特異性標記到SeF，從而實現將Bodipy593在arrestin上的定點標記作為受體，同時，研究團隊在arrestin的特異位點插入了CCPGCC用以標記FlAsH-EDT2來作為供體，借助清華大學TRIF熒光顯微鏡平臺，通過點擊反應進行單分子FRET檢測磷酸化GPCR調控arrestin的不同構象狀態分布。

　　該方法創新性地利用基因密碼子擴展技術將非天然氨基酸SeF整合到arrestin的特定位點，通過取代反應實現了高效率、特異性標記Bodipy593，標記后的SeF-Bodipy593相比較Bodipy593出現了47 nm的紅移，更能降低信號的背景噪音。相比傳統的Cy3-Cy5標記方法，避免了arrestin蛋白中的所有Cysteine突變，SeF-Bodipy593和FlAsH以更短的linker實現了染料對蛋白的特異性標記，更易精準的檢測出arrestin在激活前后微小的構象變化及其狀態分布。

　　研究工作得到國家重點研發計劃、國家杰出青年科學基金和國家自然科學基金等的支持。

Se-Click和smFRET檢測磷酸化GPCR調控arrestin構象變化及狀態分布