以哺乳動物基因組DNA為例，介紹Southern印跡雜交的基本步驟。
一、 待測核酸樣品的制備
（一）制備待測DNA
基因組DNA是從動物組織（或）細胞制備。1.采用適當的化學試劑裂解細胞，或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質和RNA；3.用有機試劑（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白質。
（二） DNA限制酶消化
基因組DNA很長，需要將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析，通常用限制酶消化DNA。一般選擇一種限制酶來切割DNA分子，但有時為了某些特殊的目的，分別用不同的限制酶消化基因組DNA。切割DNA的條件可根據不同目的設定，有時可采用部分和充分消化相結合的方法獲得一些具有交叉順序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加熱滅活限制酶,樣品即可直接進行電泳分離，必要時可進行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品后再進行電泳分離。
二、 瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品
（一）基本原理
Southern印跡雜交是先將DNA樣品(含不同大小的DNA片段)先按片段長短進行分離，然后進行雜交。這樣可確定雜交靶分子的大小。因此，制備DNA樣品后需要進行電泳分離。在恒定電壓下，將DNA樣品放在0.8～1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，標準的瓊脂糖凝膠電泳可分辨70－80000bp的DNA片段，故可對DNA片段進行分離。但需要用不同的膠濃度來分辨這個范圍內的不同的DNA片段。原則是分辨大片段的DNA需要用濃度較低的膠，分辨小片段的DNA則需要濃度較高的膠。經過一段時間電泳后，DNA按分子量大小在凝膠中形成許多條帶，大小相同的分子處于同一條帶位置。另外為了便于測定待測DNA分子量的大小或是所處的分子大小范圍，往往同時在樣品鄰近的泳道中加入已知分子量的DNA樣品即標準分子量DNA （DNA marker）進行電泳。DNA marker可以用放射性核素進行末端標記，通過這種方式，雜交后的標準分子量DNA也能顯影出條帶。
（二） 基本步驟
1. 制備瓊脂糖凝膠，盡可能薄。DNA樣品與上樣緩沖液混勻，上樣。推薦使用的靶基因的上樣量見不同條件下上樣本的使用指針比較表。一般而言，對地高辛雜交系統，所需DNA樣品的濃度較低，每道加2.5-5μg人類基因組DNA；如果基因組比人類DNA更復雜（如植物DNA）則上樣量可達10μg；每道上質粒DNA<1ng。
2. 分子質量標志物（DIG標記）上樣。
3. 電泳，使DNA條帶很好的分離。4. 評價靶DNA的質量。在電泳結束后，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min，紫外燈下觀察凝膠。
三、電泳凝膠預處理
（一）原理
DNA樣品在制備和電泳過程中始終保持雙鏈結構。為了進行有效地實現Southern印跡轉移，對電泳凝膠做預處理十分必要。分子量超過10kb的較大的DNA片段與較短的小分子量DNA相比，需要更長的轉移時間。所以為了使DNA片段在合理的時間內從凝膠中移動出來，必須將最長的DNA片段控制在大約2kb以下。DNA的大片段必須被打成缺口以縮短其長度。因此，通常是將電泳凝膠浸泡在0.25mol/L 的HCl溶液短暫的脫嘌呤處理之后，移至于堿性溶液中浸泡，使DNA變性并斷裂形成較短的單鏈DNA片段，再用中性pH的緩沖液中和凝膠中的緩沖液。這樣，DNA片段經過堿變性作用，亦會使之保持單鏈狀態而易于同探針分子發生雜交作用。
（二）基本步驟
1. 如果靶序列>5kb，則需進行脫嘌呤處理。
(1) 把凝膠浸在0.25mol/L HCl中，室溫輕輕晃動，直到溴酚藍從藍變黃。
注意：處理人類基因組DNA≤10分鐘；處理植物基因組DNA≤20分鐘。
(2) 把凝膠浸在滅菌雙蒸水中
2. 如果靶序列<5kb，則直接進行下面的步驟
(1) 把凝膠浸在變性液（0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl）中，室溫2×15分鐘，輕輕晃動。
(2) 把凝膠浸在滅菌雙蒸水中
(3) 把凝膠浸在中和液中（0.5mol/L Tris-HCl，pH7.5，1.5mol/L NaCl），室溫2×15分鐘。
(4) 在20×SSC中平衡凝膠至少10分鐘。
四、轉膜
即將凝膠中的單鏈DNA片段轉移到固相支持物上。而此過程最重要的是保持各DNA片段的相對位置不變。DNA是沿與凝膠平面垂直的方向移出并轉移到膜上，因此，凝膠中的DNA片段雖然在堿變性過程已經變性成單鏈并已斷裂，轉移后各個DNA片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置仍然一樣，故而稱為印跡（blotting）。用于轉膜的固相支持物有多種，包括硝酸纖維素膜（NC膜）、尼龍（Nylon）膜、化學活化膜和濾紙等，轉膜時可根據不同需要選擇不同的固相支持物用于雜交。其中常用的是NC膜和Nylon膜。各種膜的性能和使用情況比較見各種尼龍膜性能及使用情況比較表。
五、探針標記
用于Southern印跡雜交的探針可以是純化的DNA片段或寡核苷酸片段。探針可以用放射性物質標記或用地高辛標記，放射性標記靈敏度高，效果好；地高辛標記沒有半衰期，安全性好。人工合成的短寡核苷酸可以用T4多聚核苷酸激酶進行末端標記。探針標記的方法有隨機引物法、切口平移法和末端標記法。
六、預雜交（prehybridizafion）
將固定于膜上的DNA片段與探針進行雜交之前，必須先進行一個預雜交的過程。因為能結合DNA片段的膜同樣能夠結合探針DNA，在進行雜交前，必須將膜上所有能與DNA結合的位點全部封閉，這就是預雜交的目的。預雜交是將轉印后的濾膜置于一個浸泡在水浴搖床的封閉塑料袋中進行，袋中裝有預雜交液，使預雜交液不斷在膜上流動。預雜交液實際上就是不含探針的雜交液，可以自制或從公司購買，不同的雜交液配方相差較大，雜交溫度也不同。但其中主要含有鮭魚精子DNA（該DNA與哺乳動物的同源性極低，不會與DNA探針DNA雜交）、牛血清等，這些大分子可以封閉膜上所有非特異性吸附位點。具體步驟如下：
（一） 配制預雜交液：6XSSC，5XDenhardt’s試劑，0.5%SDS，50%(v/v)甲酰胺，ddH2O，100ug/ml鮭魚精DNA變性后加入。注：1.每平方硝酸纖維素膜需預雜交液0.2ml。2.預雜交液制備時可用或不用poly(A)RNA。3.當使用32P標記的cDNA作探針時，可以在預雜交液或雜交液中加入poly(A)RNA以避免探針同真核生物DNA中普遍存在的富含胸腺嘧啶的序列結合。4.按照探針、靶基因和雜交液的特性確定合適的雜交溫度（Thyb）。（如果使用標準雜交液，靶序列DNA GC含量為40%，則Thyb為42℃。）
（二）把預雜交液放在滅菌的塑料瓶中，在水浴中預熱至雜交溫度。
（三）將表面帶有目的DNA的硝酸纖維素濾膜放入一個稍寬于濾膜的塑料袋，用5-10ml2×SSC浸濕濾膜。
（四）將鮭魚精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。
（五）從塑料袋中除凈2×SSC，加入預雜交液，按每平方濾膜加0.2ml。
（六）加入變性的鮭魚精DNA置終濃度200μg/ml。
（七）盡可能除凈袋中的空氣，用熱封口器封住袋口，上下顛倒數次以使其混勻，置于42℃水浴中溫育4h.
七、Southern雜交
（一）原理
轉印后的濾膜在預雜交液中溫育4-6h，即可加入標記的探針DNA（探針DNA預先經加熱變性成為單鏈DNA分子），即可進行雜交反應。雜交是在相對高離子強度的緩沖鹽溶液中進行。雜交過夜，然后在較高溫度下用鹽溶液洗膜。離子強度越低，溫度越高，雜交的嚴格程度越高，也就是說，只有探針和待測順序之間有非常高的同源性時，才能在低鹽高溫的雜交條件下結合。
（二） 步驟
1.將標記的DNA探針置沸水浴10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。
2.從水浴中取出含有濾膜和預雜交液的塑料袋，剪開一角，將變性的DNA探針加到預雜交液中。
3.盡可能除取袋中的空氣，封住袋口，滯留在袋中的氣泡要盡可能地少，為避免同位素污染水浴，將封好的雜交袋再封入另一個未污染的塑料袋內。
4.置42℃水浴溫育過夜（至少18h）。
八、洗膜
取出NC膜，在2XSSC溶液中漂洗5min，然后按照下列條件洗膜：2×SSC/0.1%SDS，42℃，10min，1S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min，0.5S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min，0.2×SSC/0.1%SDS，56℃，10min，0.1×SSC/0.1%SDS， 56℃，10min。采用核素標記的探針或發光劑標記的探針進行雜交還需注意的關鍵一步就是洗膜。在洗膜過程中，要不斷振蕩，不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強度。當放射強度指示數值較環境背景高1-2倍時，即停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水分，并用保鮮膜包裹。注意保鮮膜與NC膜之間不能有氣泡。
九、放射性自顯影檢測
（一）將濾膜正面向上，放入暗盒中（加雙側增感屏）。
（二）在暗室內，將2張X光底片放入曝光暗盒，并用透明膠代固定，合上暗盒。
（三）將暗盒置-70℃低溫冰箱中使濾膜對X光底片曝光（根據信號強弱決定曝光時間，一般在1-3天）。
（四）從冰箱中取出暗盒，置室溫1-2h，使其溫度上升至室溫，然后沖洗X光底片（洗片時先洗一張，若感光偏弱，則在多加兩天曝光時間，再洗第二張片子）。（注：注意同位素的安全使用）