上海藥物所揭示阿片受體家族與內啡肽系統的分子機制

　　內源阿片系統由四個阿片受體成員以及一系列阿片肽組成，廣泛分布在中樞神經系統、外周神經系統和免疫系統，調控鎮痛、欣快、獎賞、認知、應激等信號通路，是臨床用于治療疼痛、焦慮等疾病的重要靶標。

　　阿片受體家族共有四個成員即μOR、δOR、κOR、NOPR，均屬于G蛋白偶聯受體，主要通過偶聯下游Gi蛋白發揮功能。阿片受體不僅會被體內產生的阿片肽激活，而且會被外源的阿片類/非阿片類藥物激活，包括嗎啡、芬太尼等藥物。2022年11月10日，中國科學院上海藥物研究所研究員徐華強/副研究員莊友文團隊聯合研究員謝欣團隊、教授王明偉團隊，首次報道了嗎啡和芬太尼結合人源μOR-Gi蛋白信號復合體的結構，揭示了二者在結合μ型阿片受體上的關鍵差異因素（Cell）。

　　靶向μOR的小分子阿片藥物廣泛用于臨床中至重度的急性疼痛，而它們在強效鎮痛的同時伴隨著耐藥、呼吸抑制、成癮等嚴重的副作用。為了開發更低毒副作用的鎮痛類藥物，科研人員將目光聚焦到其他亞型阿片受體的激動劑上，這促進了一些鎮痛藥物的研發，包括靶向κOR的地佐辛、鹽酸噴他佐辛酯、納布啡癸二酸、氫溴酸依他佐辛等上市藥物，靶向δOR的SRI-22138、BMS986187等臨床在研藥物，靶向NOPR的PPL-138、LY-2940094等臨床在研藥物（源于藥渡數據）。相關研究盡管已有進展，但由于小分子藥物較差的選擇性和藥理活性，引發了其他副作用——致幻、驚厥、癲癇等，導致其臨床進展受到阻礙、甚至被終止。

　　人體中的阿片肽不僅是強效鎮痛藥嗎啡等外源阿片藥物的天然模板，而且在機體自身分泌的濃度下不會導致成癮、呼吸抑制等副作用。內源性的阿片肽對四種阿片受體具有很高的親和力、激動活性、高度選擇性，這賦予其重要的研發價值。內啡肽是阿片肽眾多成員中的一種多肽神經遞質，會在身體感到疼痛或者有壓力時被釋放，有助于減輕疼痛、緩解壓力。內啡肽也會在按摩、跑步、游泳等鍛煉運動中被釋放，并通過機體的獎賞信號通路來提升人的幸福感。阿片肽由一系列前體蛋白經過酶解和修飾得到，包括內啡肽、強啡肽、腦啡肽和痛敏肽等。除了內源性的阿片肽以外，阿片受體也會被外源的多肽激活，包括食物中的酪啡肽、青蛙皮膚表面的皮啡肽等。

　　隨著X-射線晶體技術和冷凍電鏡技術的發展，近20年間已有超過800個GPCR相關的結構被報道（源于GPCRdb）。阿片受體作為一類重要的藥物靶標，該家族的失活和激活結構被相繼發表。在此前的研究中，較多備受關注的科學問題得以解釋，包括阿片受體與小分子拮抗劑/激動劑的結合模式、鈉離子口袋介導的激活機制、μOR的偏向性機制等。然而，內源性阿片肽配體如何選擇性識別并激活不同亞型阿片受體的分子機制尚不清楚，阻礙了科學家對阿片肽的認知與合理的設計改造。

　　1月12日，上海藥物所徐華強/莊友文團隊聯合美國北卡羅萊納大學教堂山分校Bryan L. Roth團隊，以長文形式在《細胞》（Cell）上，在線發表了題為Structures of the entire human opioid receptor family的研究論文。該研究系統分析和明確了各內源性阿片肽對阿片受體的信號活性，并進一步解析了阿片受體家族四個亞型（μOR、δOR、κOR、NOPR）以及各自的選擇性阿片肽包括內啡肽、內嗎啡肽、強啡肽、皮啡肽和痛敏肽的冷凍電鏡復合物結構。同時，該工作結合大量細胞水平的功能實驗，揭示了多肽類配體和阿片受體的結合模式，闡述了它們的選擇性和保守性機制，為“信使-信箱-效能”模式提供了結構和功能支持。

　　本研究通過細胞水平的功能實驗，較為系統地分析了阿片肽對野生型阿片受體的的信號傳導特性。由于內啡肽和腦啡肽對μOR、δOR的激活程度相近，為了系統地闡述選擇性差異，研究最終鎖定了內啡肽以及選擇性更顯著的內嗎啡肽、強啡肽、痛敏肽和外源的皮啡肽作為研究對象，分別解析了內啡肽-μOR、內嗎啡肽-μOR、強啡肽-κOR、痛敏肽-NOPR、皮啡肽-δOR的高分辨率冷凍電鏡三維結構，并利用第二信使cAMP的抑制試驗、G蛋白和arrestin蛋白的招募實驗來分析突變體的特性。

　　研究發現，所有的阿片肽均是以N端插入的方式進入受體。阿片肽的N端基序YGGF（痛敏肽是FGGF）“信使”結合在阿片受體極為保守的正構結合口袋腔室里，第一個酪氨酸/苯丙氨酸主鏈上的胺基均與D3.32Q2.60Y7.43基序形成極性網絡。該保守腔室對配體的識別和藥理活性必不可少，合成的YGGF四肽便可以通過較弱的作用激活四個受體（EC50約10μM）。結構分析發現，阿片受體的胞外端，主要為ECL2/3以及TM2/6/7的胞外端在序列和帶電性上均具有差異性，例如κOR和NOPR的ECL2富含帶負電的氨基酸，對應的強啡肽和痛敏肽在ECL2處富含帶正電的氨基酸。大規模功能突變實驗結果表明，阿片受體ECL2/3和TM2/6/7的胞外端序列不保守性和帶電差異性共同決定阿片受體對阿片肽的選擇性結合。

　　NOPR是阿片受體家族中最后一個被發現的受體，未被冠以希臘字母名稱。本研究解析的痛敏肽結合NOPR的結構是首個激活形式NOPR的結構，且通過結構比對分析發現其遵循阿片受體通用的激活機制。此外，阿片受體對于下游Gi蛋白有著極高的選擇性。本研究發現阿片受體的ICL3會形成一個短的α螺旋與Gi形成疏水作用，同時保守的精氨酸與Gi形成靜電作用。這可以部分解釋Gi結合的GPCR結構均含有完整的ICL3，而與其他亞型G蛋白（Gs、Gq）結合的GPCR結構中往往缺失了ICL3的電子云密度的原因。

　　綜上，科研團隊通過解析阿片肽結合的阿片受體結構，闡釋了多肽配體的結合模式，揭示了阿片受體中保守的結合口袋以及獨特的ECL2/3共同介導阿片肽的作用機制，剖析了阿片受體通用的激活機制以及對下游Gi蛋白的選擇性特征。上述研究為探索阿片系統的生物學特性奠定了堅實的結構基礎，并為設計新型高效的阿片肽類鎮痛藥物鋪平了道路。

　　研究工作得到國家自然科學基金、國家重點研發計劃、上海市科技重大專項、中科院特別助理研究項目，以及美國國立心理健康研究院、美國國立衛生研究院等的支持。美國溫安洛研究所科研人員參與研究。

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