為什么需要對DNA進行純化

為什么需要對DNA進行純化
質粒DNA純化的試驗原理：
溴化乙錠通過嵌入堿基之間而與DNA結合，進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環質粒DNA中引入超螺旋單位。最后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分子的繼續嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續結合更多溴化乙錠，直至達到飽和( 每2個堿基對大約結合1個溴化乙錠分子) 。由于染料的結合量有所差別，線狀和閉環DNA分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質粒DNA 的首選方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質粒DNA和宿主DNA的方法。盡管這些方法大多數均被束之高閣，但其中最好的方法，也應是聚乙二醇分級沉淀法。
從大腸桿菌細胞中分離質粒DNA的方法眾多，其分離的依據可利用分子大小不同，堿基組成的差異以及質粒DNA的超螺旋共價閉合環狀結構的特點來進行。堿基性法抽提效果良好，既經濟且得率較高。抽提到的質量DNA可用于酶切、連接和轉化。對于分子量較大拷貝較少對的質粒DNA，由于DNA片段較大易于損傷斷裂，因此選用呂華銫密度超高離心法抽提DNA，且具有純度高、步驟少、方法穩定且獲得的質量DNA是超螺旋構型等特點。對于高拷貝數質粒，用少量制備法抽提質粒DNA就有足夠量可用于基因操作。

質粒DNA純化的試驗步驟：
測量DNA溶液的體積，按lg/ml的用量精確地加入固體CsCl, 將溶液加溫至30℃助溶。溫和地混勻溶液直到鹽溶解。
每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水）；立即將溴化乙錠溶液（漂浮在表層）與DNA－氯化銫溶液混勻， 溶液的終密度應為1.55g/ml（溶液的折射率為1.3860）溴化乙錠濃度大約740μg/ml。【溴化乙錠貯存液應貯存于避光容器內（如用錫箔完全包裹的瓶子），于室溫保存。
室溫下用Sorvall SS34頭（或與其相當的轉頭）以8000rpm離心5min， 浮在溶液上面的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細菌蛋白所形成的復合物。
用巴斯德吸管或帶大號針頭的一次性注射器將浮渣下的清亮紅色溶液轉移到離心管中。用輕石蠟油加滿管的其余部分并封口。
以20℃對所得的密度梯度以45 000rpm離心16h（VTi65 轉頭）、 以45 000rpm離心48h（Ti50轉頭）、以60 000rpm離心24h（Ti65轉頭）或者以60 000rpm離心24h（Ti70.1轉頭）。普通光照下，在梯中心可見兩條DNA區帶， 上部區帶材料通常較少，由線狀的細菌（染色體）DNA和帶切口的環狀質粒DNA組成：下部區帶則由閉環質粒DNA組成。管底部深紅色的沉淀是溴化乙錠RNA復合物，位于CsCl溶液和石蠟油之間的是蛋白質。Beckman Quick-Seal離心管中的CsCl－溴化乙錠梯度可容納4mg 閉環質粒DNA而不至超負荷。如有更大量的質粒存在，將擴展為一條寬帶，并與染色體DNA相重疊。這種問題只有在質粒復制達到極高水平時才會出現，只要將該質粒提取物分為2個梯度即可解決。如出現負荷，可收集整個DNA區高產水平時才會出現，只要將該質粒提取物分為2個梯度即可解決。如出現超負荷，可收集整個DNA區帶，用CsCl溶液（ρ=1.58g/ml）將體積調到15ml，在兩個離心管中再度離心，使DNA達到平衡。
收集DNA帶。將21 號皮下注射針頭插入管的頂端以使空氣進入，為盡量減少污染的機會，首先用18號皮下注射針頭按下述方法收集上部的區帶（雜色體DNA）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后將一塊Soctch膠帶貼于管外壁。穿過Soctch膠帶將18號皮下注身針頭（其斜面向上）插入管中，以便使針頭的斜面開口恰好位于染色體DNA區帶之下并與該區帶相平行。將粘稠狀DNA收集到一次性使用的管內，用造型粘土塊封住皮下注射針頭的末端并將第2根針頭留于原處。 穿過Soctch 膠帶插入第3根皮下注射針頭（18號），將下部的質粒DNA區帶收集到玻璃或塑料管中。