從成年骨骼肌分離和培養成肌細胞實驗

骨豁肌源性成肌細胞能夠培養從幾種成年動物骨骼肌分離的成肌細胞。在培養條件下，成肌細胞仍繼續表達一些分化特征。成肌細胞稱衛星細胞，分化早期的步驟與骨骼肌很相似。成肌細胞在培養底物上增殖和遷移，然后成直線排列，最終融合形成多細胞核肌管。在單肌纖維培養，按整塊取骨骼肌。用膠原蛋白液孵育，以消化結締組織。然后，輕微機械性研磨使肌纖維分離。可從骨骼肌分離出肌纖維及其衛星細胞。在添加 20%（fetal bovine serum， FBS) 的 Ham's F12 培養中，原代細胞容易生長。在不改變培養條件的情況下，這些細胞增殖和分化，融合形成多個細胞核的肌管。這證明培養的細胞具有成肌性

活檢組織塊

Ham F12 FBS D-PBSA

手術刀 長剪刀 Petri 培養皿 離心管 血細胞計數板

一、材料

無菌 

1. 轉運培養液：Ham F12（Seromed 08101），不含 NaHCO₃，含有 20 mmol/LHEPES(Serva 25245),75 ml

2. 生長培養液: Ham F12, 添加 20%FBS（Gibco 011-06290），200 ml 

3. 鏈霉菌蛋白酶液：0.15% 鏈霉菌蛋白酶（Sigma P-6911）、0.03% EDTA（Merck 8418）、20IU/ml 青霉素和 20ug/ml 鏈霉素（0.4%Eurobio PES300），用 Ham F12 或 D-PBSA 配制 100 ml 

4. D-PBSA：100 ml

5. 尼龍網：孔徑為 100um

6. 手術刀 

7. 鋒利的長剪刀 

8. Petri 培養皿：直徑為 90 mm，用于切組織塊 

9. 培養皿：25 cm²，4 個 

10. 20 ml 離心管或一般容器，5 只 

非滅菌 

1. 血細胞計數板 

二、操作步驟：

1. 分離：用手術刀切除活檢組織塊上的非肌性組織，然后用 D-PBSA 浸洗。

2. 稱重前，與肌纖維平行將切除活檢組織切成片，用 D-PBSA 沖洗。

3. 將組織片平行放入 Petri 培養皿蓋內，切成較薄的柱狀組織塊，然后切成 1 mm³小塊。不要擠壓組織。也可在試管內用長剪刀將組織簡稱小塊，應避免擠壓組織。

4. 用 D-PBSA 浸洗組織塊，靜置后吸取上清液。

5. 在 37℃ 條件下，用鏈霉菌蛋白酶液消化組織塊 1 h。每 1~3 mg 組織塊用 15 ml 鏈霉菌蛋白酶液。每間隔 10~15 min 輕輕搖晃試管。

6. 孵育后用吸管研磨組織塊。由于越來越多的細胞分離下來，培養液會逐漸變得渾濁。

7. 讓組織塊沉到試管的底部，形成沉降的組織塊（P1）和上清液（S1）。

8. 用孔徑為 100um 的尼龍網將 S1 濾入 20 ml 離心管。輕輕搖晃或用吸管吹打上清液，使細胞混懸。

9. 離心（350 g，8~10 min）后，吸取上清液。

10. 準確加入 10 ml 生長培養液，用帶有橡皮吸頭的吸管很輕微地混懸細胞。然后，用血細胞計數板計數細胞。

11. 用生長培養液稀釋細胞懸液，以約 1.5x10⁴個/ml 的細胞密度將細胞接種于培養瓶。從 1 g 健康供體活檢組織約獲得 1~2x10⁵ 個細胞。

12. 將 15 ml 消化液加入 P1，在 37℃ 水浴中孵育組織塊 30 min，并定時搖晃。

13. 用吸管吹打細胞懸液，使細胞分散。然后，用尼龍網過濾細胞懸液。用 20 ml 生長培養液浸洗濾網。

14. 離心（350 g，8~10 min）后，計數細胞，按上述方法接種細胞。

15. 將培養瓶移入濕潤的培養箱，在 37℃ 和 5%CO2 的條件下培養細胞，

安全提示
在扔入垃圾前，應該用次氯酸鹽處理剩余組織和使用過的試管、吸管、培養皿。

維持培養 

16. 接種后 24 h 很輕微地換培養液，以后每 3~4d 換液 1 次。細胞主要向著分化生長。人成肌細胞的生長分 3 期，培養后 4~6d 增殖達高峰；8d 作用排列成 行；10~12d 細胞融合形成肌管增多。然而，必須記住一些細胞可能分化較早，絕大多數細胞分化時一些細胞仍處于增殖狀態。

傳代培養 

17. 將少量 EDTA 輕輕注在細胞上面后立即吸取。

18. 加入 0.25% 胰蛋白酶液，足以在細胞上面形成一薄層。

19. 當細胞去附著時，加入 5~10 ml 完全生長培養液，用吸管很輕微地吹打細胞，然后離心（350 g，10 min）。

20. 計數細胞，按一定密度種植細胞。

1. 在扔入垃圾前，應該用次氯酸鹽處理剩余組織和使用過的試管、吸管、培養皿。                                     
   

2. 培養液需要在無菌的環境下才能打開，避免污染。

1. 成肌細胞稱衛星細胞，分化早期的步驟與骨骼肌很相似。成肌細胞在培養底物上增殖和遷移，然后成直線排列，最終融合形成多細胞核肌管。盡管用胰蛋白酶消化法可將成肌細胞傳代培養3 ? 4 代，但一旦分化（融合）即不能傳代培養。

2. 成肌細胞特點：易于獲取，來源廣泛，易于分離且體外培養增殖快，并在培養階段易于接受外源基因。

來源：《動物細胞培養：基礎技術指南（第五版）》