先進科學：基因編輯如何擺脫“脫靶”困擾

　　基因組編輯技術是當前生命科學研究的前沿領域。在多種不同的基因組編輯方法，以CRISPR/Cas9系統最為便捷、高效，應用也最廣泛。

　　但CRISPR技術存在的脫靶效應依舊是影響其能否廣泛應用的主要限制因素，如何正確評估、檢測脫靶效應，并提出相應的策略降低脫靶效應，是當前基因編輯研究領域的重要研究方向。

　　近日，華中農業大學棉花遺傳改良團隊一篇相關綜述，系統總結了當前的基因編輯工具、基因編輯產生的脫靶效應及類型、脫靶效應的機理、動植物的脫靶效應存在的問題；并總結了如何進行sgRNA設計，脫靶效應的評估和預測，避免和減輕脫靶效應的策略以及對預期基因組編輯結果的影響。該論文在線發表于國際綜合性期刊《先進科學》。

CRISPR/Cas9系統的脫靶效應。金雙俠供圖

金雙俠在華中農大作物遺傳改良國家重點實驗室查看基因編輯的棉花材料。

　　基因編輯雖好，脫靶是個問題

　　相對于以往研究基因功能的工具，以CRISPR/Cas9 為代表的基因編輯的效率和準確性都較高，但也會帶來一個可能“致命”的問題——脫靶效應。

　　“基因編輯可以‘指哪打哪’。一般只要20個核苷酸序列就能對一個基因進行定位并定點敲除。但同時，在基因組序列中，與特定20個核苷酸序列相近的堿基片段非常多。基因編輯過程中，與導向RNA靶向目標很接近的片段，也會結合上去并被敲除掉，這就是所謂的‘脫靶’。”華中農業大學植物科學技術學院教授、論文共同通訊作者金雙俠在接受《中國科學報》采訪時解釋到。

　　金雙俠強調，由于可以結合的潛在脫靶位點基因片段較短，所以在理論上脫靶概率還是比較高的，脫靶位點也比較多。如果脫靶現象普遍發生，對動植物來說都會是一個嚴重的挑戰，其后果是比較嚴重的。

　　在電子科技大學生命科學與技術學院教授張勇看來，基因組編輯技術在動植物育種和基礎研究工作中都很重要。但其中的脫靶效應和非特異性剪切對應用結果和研究成果的可靠性、有用性有重要影響。“目前，對于基因編輯技術的應用和發展的綜述較多，但全面綜述脫靶效應的比較少。”

　　“長期以來，學術界對植物基因編輯器和基因編輯工具的脫靶效應缺乏相關重視”，安徽省作物基因編輯中心主任、安徽省農科院水稻研究所研究員魏鵬程評價到，該綜述很好地結合了動物基因編輯技術中的前沿進展以及植物基因編輯所面臨的問題，指出了未來在脫靶效應方面到底應該做哪些工作。

　　四種脫靶檢測方法

　　根據該論文，基因編輯領域目前可以采用以下策略降低脫靶效應：開發并合理利用預測脫靶效應的有效工具，開發新的基因編輯系統，利用高質量參考基因組設計靶標和好的基因編輯工具遞送系統。“這上面幾種技術策略的利用，可以有效減少或避免脫靶。”金雙俠表示。

　　脫靶檢測最簡單有效的方法之一是全基因組測序法。通過軟件預測潛在的脫靶位點，然后將基因組測出來進行比對。如果與受體材料相比，在潛在脫靶位點沒有變化則證明沒有脫靶，有變化則有可能存在脫靶，進一步可以通過經典Sanger測序法進行驗證。“這是目前非常簡單高效，而且全面的一種方法。”金雙俠稱。

　　開發新的基因編輯系統，則是從技術源頭的角度去避免脫靶，目前出現了一些新的CRISPR/Cas系統，相比于最常用的CRISPR/Cas 9系統，有更高的精準性可以顯著地降低脫靶效應。

　　由于基因編輯中的基因組是通過基因組測序獲得的成千上萬的小片段拼接而成，受早期測序技術和拼接策略的局限，很多物種的基因組早期版本有錯誤，如果對這樣的基因組進行編輯，就好比去解讀一本錯誤百出的書本，自然會產生誤解。所以，如果沒有很好的參考基因組，很容易產生脫靶。

　　“最理想的狀態是，做每一個品種的基因組編輯時，以該品種的參考基因組去做靶標設計。”金雙俠表示，即使是同一個物種，不同的品種、品系間都存在相當大的遺傳差異，這會對脫靶、基因編輯精準性會產生很大影響。

　　好的基因編輯工具的傳遞系統應當盡量避免或者降低組織培養產生的體細胞無性系變異，也是減少脫靶或者是說提高基因編輯精準性的一個重要策略。

　　基因編輯工具未來前景

　　張勇認為，該綜述對基本概念講得非常清楚，對方法的綜述非常全面。同時也非常貼近研究工作的實際，“不是從理論到理論的、讀完別人工作后做的文獻綜述，而是結合了第一線的工作。”

　　“該綜述通過總結現有研究工作，梳理了脫靶效應這一概念的歷史，對脫靶效應的概念進行了比較系統和全面的分類。在方法層面比較全面系統闡述了怎樣從實驗角度，用不同基因編輯技術檢測脫靶效應的效率及可行性；用生物信息學、AI數據分析等預測評估脫靶效應；怎樣降低脫靶效應提高基因編輯的準確性等問題。”張勇表示。

　　目前，基因編輯最主流的三種工具分別是鋅指核酸酶（ZFN）技術，轉錄激活樣效應因子核酸酶（TALEN）技術和串聯間隔短回文重復序列（CRISPR/Cas）系統，其中以CRISPR/Cas最高效、應用最多，但其脫靶率相對來說也最高。在準確性方面，TELEN的表現最好。

　　上世紀90年代開始，生物界已經開始運用ZFN技術。2000年之后出現TALEN技術。“早期的基因編輯技術都是蛋白質遞層，也就是說要把蛋白質遞到細胞里來，釋放蛋白質的過程消耗的能量是非常大的。”魏鵬程表示，雖然TALEN技術目前來看在保真性和精確程度上比CRISPR/Cas強，但從所消耗的能量和構建藥品的成本上看，CRISPR/Cas應是基因編輯技術以后發展的一個重點。

　　金雙俠也認為，雖然三種主流工具的應用目前處于優勢互補狀態，有的科研機構會同時使用這三種工具。未來還是CRISPR/Cas更有發展潛力。

　　“CRISPR/Cas基因編輯工具目前所面臨的保真性和精確程度不足的問題，在后續發展中應該可以得到克服。”魏鵬程據此判斷的理由是，早期的CRISPR蛋白主要從自然生物中去篩選，并沒有根據需要進行人工選擇，因此能承受一部分的脫靶效應。一旦把人工選擇加進去之后，保真性很容易進化出來。“將來的發展趨勢會是CRISPR/Cas技術的日臻完善，會把它現有的一些問題，比如保真性方面的缺陷給它彌補上。” （韓天琪）