2021年7月CRISPR／Cas最新研究進展

　　基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜志列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。2020年10月，德國馬克斯-普朗克病原學研究所的Emmanuelle Charpentier博士以及美國加州大學伯克利分校的Jennifer A. Doudna博士因在CRISPR-Cas9基因編輯方面做了的貢獻榮獲2020年諾貝爾化學獎。

　　CRISPR是規律間隔性成簇短回文重復序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統。

　　2018年11月26日，中國科學家賀建奎聲稱世界上首批經過基因編輯的嬰兒---一對雙胞胎女性嬰兒---在11月出生。他利用一種強大的基因編輯工具CRISPR-Cas9對這對雙胞胎的一個基因進行修改，使得她們出生后就能夠天然地抵抗HIV感染。這也是世界首例免疫艾滋病基因編輯嬰兒。這條消息瞬間在國內外網站上迅速發酵，引發千層浪。有部分科學家支持賀建奎的研究，但是更多的是質疑，甚至是譴責。

　　即將過去的7月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下這個月生物谷報道的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。

　　1.Nat Commun：利用CRISPR-Cas13b基因編輯技術高效阻止新冠病毒及其變體在人細胞中的復制

　　doi:10.1038/s41467-021-24577-9

　　最近，令人擔憂的SARS-CoV-2病毒變體的出現突出表明需要創新方法以便同時抑制病毒復制和防止病毒逃避宿主免疫反應和抗病毒藥物治療。在一項新的研究中，澳大利亞研究人員使用一種稱為CRISPR-Cas13b的基因編輯技術成功地阻止SARS-CoV-2病毒在受感染的人類細 胞中的復制，這可能為治療COVID-19鋪平道路。鑒于這種CRISPR基因編輯工具在實驗室測試中可有效阻止這種病毒復制，他們希望盡快開始動物實驗。相關研究結果于2021年7月13日發表在Nature Communications期刊上，論文標題為“Reprogrammed CRISPR-Cas13b suppresses SARS-CoV-2 replication and circumvents its mutational escape through mismatch tolerance”。

　　這些作者采用全基因組計算預測和單核苷酸分辨率篩選，針對SARS-CoV-2基因組RNA和亞基因組RNA重編程CRISPR-Cas13b。經過重編程的效應蛋白Cas13b靶向SARS-CoV-2刺突蛋白和核衣殼蛋白編碼基因的RNA轉錄本的可訪問區域，在無病毒模型中取得了>98%的沉默效率。 此外，同時使用多種經過優化的Cas13b CRISPR RNA（crRNA）抑制了感染有復制能力的SARS-CoV-2（包括最近出現的令人關注的SARS-CoV-2病毒變體B.1.1.7）的哺乳動物細胞中的病毒復制。針對向導RNA（gRNA）-靶標相互作用的全面誘變實驗表明，單核苷酸錯配并不影 響強效的單一crRNA在感染的哺乳動物細胞中抑制SARS-CoV-2祖先毒株和SARS-CoV-2變體毒株（包括D614G變體毒株）復制的能力。

　　論文通訊作者、澳大利亞彼得-多爾蒂感染與免疫研究所的Sharon Lewin博士表示，他們設計的CRISPR-Cas13b能夠識別導致COVID-19的SARS-CoV-2病毒。在識別后，Cas13b就會切割這種病毒的基因組，從而阻止它在人細胞中的復制。

　　2.Mol Ther：腺嘌呤堿基編輯有望治療α-1-抗胰蛋白酶缺乏癥

　　doi:10.1016/j.ymthe.2021.06.021

　　單基因疾病α-1-抗胰蛋白酶缺乏癥（Alpha-1 antitrypsin deficiency, AATD）是一種常見的遺傳性疾病，會影響肝臟和肺部。一項新的研究顯示一種新的基因編輯形式能夠有效地校正AATD患者細胞中的突變。這種稱為腺嘌呤堿基編輯的新方法與包括CRISPR在內的其他 編輯形式不同，因為這種堿基編輯不會誘發DNA斷裂，這有助于防止雙鏈斷裂、潛在的脫靶編輯以及細胞修復過程中不需要的突變。相關研究結果于2021年7月1日在線發表在Molecular Therapy期刊上，論文標題為“Adenine Base Editing Reduces Misfolded Protein Accumulation and Toxicity in Alpha-1 Antitrypsin Deficient Patient ipsC-Hepatocytes”。

　　在這項新的研究中，在美國波士頓大學再生醫學中心的Andrew Wilson博士和Rhiannon Werder博士的領導下，研究人員利用稱為iHeps的患者衍生細胞。iHeps細胞模擬肝臟肝細胞的生物學特性。肝細胞是體內α-1抗胰蛋白酶蛋白的主要制造者，具有重要的代謝、內分泌 和分泌的功能。這種堿基編輯技術校正了導致AATD的Z突變，并減少了該疾病在肝細胞中的影響，從而證明了人類細胞中堿基編輯的成功。這些結果可以有助于為未來的人體臨床試驗鋪平道路。

　　Wilson說，“這項研究顯示了成功應用堿基編輯技術來校正AATD患者衍生性肝細胞中導致這種疾病的突變。我希望這些結果將為利用這項技術幫助AATD和其他單基因疾病的患者提供機會。”

　　3.Nat Commun：科學家成功利用CRISPR堿基編輯技術糾正產前溶酶體貯積病

　　doi:10.1038/s41467-021-24443-8

　　子宮內的堿基編輯或有望在機體病變發生之前來糾正致病性的突變，1型黏多糖病（MPS-IH，賀勒氏癥，指任何一種涉及黏多糖先天性代謝紊亂的疾病）是一種影響機體多個器官功能的溶酶體貯積病（LSD，lysosomal storage disease），其通常會導致個體出生后發生早 期的心肺衰竭。如今越來越多的研究證據證實了在出生前糾正致死性的遺傳性疾病可行性，近日，一篇發表在國際雜志Nature Communications上題為“In utero split AAV9 adenine base editing corrects the multi-organ pathology in a lethal lysosomal storage disease”的研究報告中，來自費城兒童醫院等機構的科學家們通過研究成功利用DNA堿基編輯技術對產前小鼠模型進行研究，糾正了一種被稱為賀勒氏癥的溶酶體貯積病。利用一種在腺相關病毒載體中運輸的腺嘌呤堿基編輯器，研究人員就能糾正負責這種疾病 的單一堿基突變，這種疾病在個體出生前就已經開始進展了，其會影響多個器官的功能，如果不及時治療的話，有可能會導致個體在兒童期就發生死亡。

　　醫學博士William H. Peranteau表示，本文研究結果表明，在臨床前小鼠模型中利用產前堿基編輯技術來治療賀勒氏癥是可行的。除了能夠展示出生前治療該疾病的益處外，研究者還發現，利用這種堿基編輯工具還能在個體出生后對其進行矯正，這就突出了該技術在產 前和產后治療賀勒氏癥的前景和希望。賀勒氏癥是一種溶酶體貯積病，在西方國家中，大約每10萬名嬰兒中就有1名嬰兒會受到該病的影響，該病的發生通常是由單一DNA堿基突變所引起的，即腺嘌呤代替了鳥嘌呤；患兒出生后6個月時，其就會出現肝臟和脾臟腫脹、腹壁 疝氣、肌肉骨骼異常、視網膜和神經認知退化及心臟病等疾病表現；如果不加以治療的話，患者在5-10歲時會因心肺并發癥而發生死亡；即使接受了治療，患者也會出現一定的疾病并發癥，因為目前的治療方法所產生的治療效果非常有限，尤其是在患兒延遲治療的情況 下。

　　由于這種疾病的病理學表現在患者出生前就已經開始了，因此研究人員認為，該綜合征是產前治療的最佳候選對象，基于這一考慮，研究人員利用CRISPR堿基編輯技術成功將MPS-IH小鼠模型中突變的腺嘌呤轉換成了鳥嘌呤，該技術只需要單鏈DNA的破裂，其要比其它編輯 方法更加有效且安全。文章中，研究人員使用了一種腺相關病毒9（AAV9）病毒載體來講堿基編輯器運輸到胎兒小鼠模型中，結果發現，接受產前治療的小鼠模型表現出了存活率的提高和機體代謝、骨骼和心臟疾病病理學表現的改善。值得注意的是，研究人員在模型機體 中的肝臟和心臟中都觀察到了修正細胞的存在，這就表明這種療法或能對多個器官有效。

　　4.Cell：揭示DNA修復蛋白RAD51可讓CRISPR基因編輯更高效

　　doi:10.1016/j.cell.2021.04.035

　　基因編輯是有目的地改變基因的DNA序列，是研究突變如何導致疾病，以及為治療目的改變一個人的DNA的有力工具。在一項新的研究中，美國麻省理工學院大腦與認知科學教授Guoping Feng及其團隊開發出一種可用于這兩種目的的新型基因編輯方法。相關研究結果近期 發表在Cell期刊上，論文標題為“Efficient embryonic homozygous gene conversion via RAD51-enhanced interhomolog repair”。

　　為了提高基因編輯過程的效率，Feng實驗室最初假設，在CRISPR基因編輯工具的標準混合物中加入一種名為RAD51的DNA修復蛋白，將增加細胞（在這種情況下是受精小鼠卵，即單細胞胚胎）發生所需基因變化的幾率。作為一個測試案例，他們測量了他們能夠插入（“敲 入”）與自閉癥有關的基因Chd2突變的速率。被正確編輯的胚胎的總體比例保持不變，但令他們驚訝的是，在兩條染色體上攜帶所需基因編輯的比例明顯更高。用一個不同的基因進行的測試也產生了同樣的意外結果。

　　Feng實驗室接下來著手了解RAD51增強基因編輯的機制。他們假設RAD51參與了一種叫做同源體間修復（interhomolog repair, IHR）的過程，即一條染色體上的DNA斷裂以該染色體的第二個拷貝（來自另一個親本）為模板進行修復。為了測試這一點，他們給小鼠胚胎注射 了RAD51和CRISPR，但沒有注射模板DNA。他們對CRISPR進行編程，只切割其中一條染色體上的基因序列，然后測試它是否被修復以匹配未切割染色體拷貝上的序列。在這個實驗中，他們不得不使用母體和父體染色體上的序列不同的小鼠。他們發現，單獨注射CRISPR的對 照組胚胎很少出現IHR修復。然而，添加RAD51顯著增加了編輯CRISPR靶向基因以匹配未切割染色體拷貝的胚胎數量。

　　Wilde說，“以前對IHR的研究已發現，它在大多數細胞中的效率低得驚人。我們發現它在胚胎細胞中更容易發生，并且可以被RAD51增強，這表明更深入地了解是什么使胚胎允許這種類型的DNA修復，可能幫助我們設計更安全和更有效的基因療法。”

　　5.eLife：改造蚊子基因是否阻止傳播瘧疾

　　doi:10.7554/eLife.58791

　　越來越多的蚊子對殺蟲劑的抗藥性，以及瘧疾寄生蟲對抗瘧藥物的抗藥性，使人們迫切需要新的方法來對抗這種疾病。蚊蟲媒介抗藥性和寄生蟲抗藥性的上升突出表明，如果要使消滅瘧疾繼續成為可行的目標，就迫切需要開發新的工具。在 eLife發表的一項初步研究表 明，改變蚊子的腸道基因，使其將抗瘧基因傳播給下一代蚊子，有望成為遏制瘧疾的一種方法。

　　這項研究是利用CRISPR-Cas9基因編輯技術對蚊子基因進行改變的一系列步驟中的最新一步，這些基因可能會降低蚊子傳播瘧疾的能力。如果進一步的研究支持這一方法，它將為減少瘧疾引起的疾病和死亡提供一種新的方法，也是控制瘧疾的很有希望的工具。

　　研究人員對傳播瘧疾的蚊子岡比亞按蚊進行了基因改造。他們使用CRISPR-Cas9技術在蚊子進食血粉后打開的基因中插入了一種編碼抗瘧蛋白的基因。研究小組這樣做的方式，使整個部分的DNA也發揮了基因驅動作用，可以傳遞給大多數蚊子的后代。他們最初將該基因與 熒光標記一起插入，以幫助他們在DNA中的三個不同點追蹤該基因，然后移除該標記，只留下一個小的基因修飾。接下來，他們培育了這些蚊子，看看它們是否能夠成功繁殖并保持健康。他們還測試了瘧原蟲在蚊子體內的發育情況。

　　這些基因改造是被動的，可以在現場進行測試，并經過嚴格的監管程序，保證它們能夠安全有效地阻斷寄生蟲，不會引起人們對環境中意外傳播的擔憂。把它們和其他蚊子結合在一起，再加上一種活躍的基因驅動，它們就會變成基因驅動，而不需要任何進一步的改變。 這些研究使基因驅動技術在這一領域更接近于作為一種消滅瘧疾的策略而被測試。

　　6.Cell：新研究揭示結核桿菌的脆弱性基因和非脆弱性基因

　　doi:10.1016/j.cell.2021.06.033

　　開發防治結核病的藥物可能是一件令人沮喪的事情。一旦發現對細菌的生命周期至關重要的基因，科學家們急于開發抑制該靶標的藥物，然后是失望。一系列靶向必需基因靶標的化合物對結核桿菌的生長幾乎沒有影響。這種細菌繼續生存。科學家們又回到了原點。如今 ，一項新的研究有助于解釋為何基于靶標的抗生素在起步階段遇到如此多的麻煩。一個答案是，必需基因靶標在對抗生素的脆弱程度上有所不同。來自美國洛克菲勒大學和威爾康乃爾醫學院的研究人員發現，理想的靶標是如此容易受到攻擊，以至于當它被輕微抑制時， 細胞就無法生存。另一方面，非脆弱性基因（invulnerable gene）可以經受住幾乎完全的抑制，在遭受抗生素的攻擊時也能勉強維持足夠的靶標活性而使細胞存活。此外，這些作者首次對病原體的脆弱性進行了量化，產生了一個指數，用于根據使基因失效并使細胞癱瘓 所需的抑制量對結核桿菌中的幾乎每一個必需基因進行排名。相關研究結果于2021年7月22日在線發表在Cell期刊上，論文標題為“Genome-wide gene expression tuning reveals diverse vulnerabilities of M. tuberculosis”。

　　Rock和他的團隊決定對結核桿菌的基因脆弱性進行量化，這種病原體每年奪走140萬人的生命。他們開發了一種基于CRISPR干擾（CRISPRi）的功能性基因組學方法，一次性查看這種病原體的整個基因組，并根據為了殺死這種細菌每個必需基因需要被抑制的程度對其進行 排名。

　　論文共同第一作者、Rock實驗室醫生科學家Barbara Bosch說，“我們開發了一種可以調整的系統，從沒有抑制到幾乎100%的抑制。這使我們能夠確定這種細菌是否有嚴重的適應度成本（fitness cost），或者它們是否仍然活著和活躍。”

　　由此產生的脆弱性指數，將抑制百分比與細菌的適應度聯系起來，表明脆弱性是決定抗生素是否成功的一個關鍵因素。例如，兩個最脆弱的基因恰好也是市場上兩種最強效的抗結核病藥物的靶標。相反，兩個最不脆弱的基因，即coaA和def，曾經是很有希望的藥物靶標， 但是靶向這些基因的抗生素卻未能殺死這種細菌。這些靶標的非脆弱性可能是這些藥物失敗的一個原因。

　　這種脆弱性指數還確定了幾個新的靶標，這些靶標是必需的，高度脆弱的，而且是藥物開發商尚未探索的。其中的一些靶標甚至比目前的一線抗結核病藥物更脆弱，并令人吃驚地影響著細胞中的各種活動。