免疫組織化學染色方法

實驗概要

免疫組織化學染色法是指在抗體上結合熒光或可呈色的化學物質，利用免疫學原理中抗原和抗體間專一性的結合反應，檢測細胞或組織中是否有目標抗原的存在，此方式不只可以用來測知抗原的表現量也可觀察抗原所表現的位置。只要是能夠讓抗體結合的物質，也就是具有抗原性的物質包括蛋白質、核酸、多糖、病原體等都可偵測。

實驗原理

免疫細胞化學（immunocytochemistry）是根據免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結合，對抗原進行定位測定的技術。抗原主要為大分子或與大分子相結合的小分子；抗體則是由漿細胞針對特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果將抗體結合上標記物，再與組織中的抗原發生反應，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。

常用的標記物有熒光素和酶。熒光素標記的稱為免疫熒光法（immunofluorescent technique），常用的螢光素有異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate）、羅丹明（rhodamine）等。酶標記的稱為酶標免疫法（enzyme-labeled antibody method），常用的酶有辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase），酶與底物發生反應后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。

抗體與抗原的結合方法可分為直接法和間接法兩種，直接法是將帶有標記的抗體與抗原反應，顯示出抗原存在的部位。而間接法則是在抗體抗原初級反應的基礎上，再用帶標記的次級抗體同初級抗體反應，從而使初級反應得到放大，顯示增強。

實驗步驟

1. 石蠟切片4-5μm；

2. 切片脫蠟至水；

3. 3%甲醇雙氧水阻斷室溫10分鐘；

4.  0.01M(PH 7.2)磷酸鹽緩沖液洗5分鐘3次；抗原修復，加入0.01M（PH 6.0）檸檬酸緩沖液置微波爐中10檔3分30秒，之后可進行2檔1分至1分30秒微波維持。

5. 自然冷卻后洗，加二抗同種動物非免疫血清封閉，室溫10分鐘；

6. 免洗，傾出血清，分別滴加配制好的一抗4℃過夜；

7. 洗5分鐘3次；

8. 滴加生物素標記的第二抗體，室溫孵育10分鐘；

9. 洗5分鐘3次；

10. 滴加鏈親和素-過氧化物酶，室溫10分鐘；

11. 洗5分鐘3次；

12. 新鮮配制的DAB溶液顯色3-10分鐘；

13. 自來水洗，蘇木素淺染細胞核，分化。自來水沖洗返蘭，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。