全新雙重熒光定量PCR方法助力細菌污染核酸檢測

　　目前，核酸篩檢系統（Nucleic Acids Testing，NAT）已廣泛用于血制品常規病原體（乙肝、丙肝、艾滋、梅毒）的核酸檢測，極大降低了相關疾病的輸血傳播。但是，在輸血感染性風險中，血小板的細菌污染及相關敗血癥性輸血反應仍是棘手的問題。將核酸篩檢技術用于細菌污染檢測還有不少困難，包括：1、細菌污染不像特定病原體，沒有統一的標準品；2、缺少合適的內參質控排除假陽性或假陰性結果；3、核酸擴增聚合酶（Taq）大多是細菌來源，帶有痕量的細菌核酸成分。

　　近期，中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所血液免疫學研究中心提出一種雙重熒光定量PCR方法可提高細菌污染檢測的可靠性：設計一條人工核酸序列（IRC）作為內參，其特點是IRC與靶基因共用同一對引物進行擴增，分別用不同熒光探針進行檢測。通過精確控制IRC分子數達到陽性檢出限，以其Ct(i)值作為閾值，只有樣本檢測的Ct(s)值小于或等于Ct(i)時，檢測結果才可認定為陽性。一種雙樣本混合的t測驗（two samples pooled t-test）統計學方法可用于幫助判斷兩個Ct值的大小。IRC還可以包裝成噬菌體，用于監控核酸樣本提取過程。

　　此外，該雙重熒光定量PCR方法可通過分別檢測細菌的DNA（脫氧核糖核酸）與RNA（核糖核酸），計算不同Ct的比值，能判斷細菌是處于生長繁殖期或者已經是死菌，從而幫助判斷血制品滅活的效果。該方法不僅能用于血制品細菌污染檢測，理論上也能開發成其他外源基因核酸定量檢測的有效方法。

　　相關研究結果已發表在PLOS ONE（2015，10(7)：e0134743）上。

　　以上工作得到江蘇省自然科學基金、蘇州市科技專項項目的支持。

圖-1、IRC雙重熒光定量PCR原理圖