關于全血的保存DNA提取pcr個人經驗

做了好多DNA提取保存，吃了很多虧給大家點建議吧：（有疑問可以回帖，有時間我會回答如果我知道）。

血液保存：
EDTA抗凝最好，肝素也可以不過經常會影響后續試驗，一般可以保存在-20和-80保存3-5年沒有問題——保存時間越長似乎dna提取越少，再長時間我也沒有試過，注意解凍一次大概損失20%左右（提取感覺估計得到的可能不準），放的時間長也會降解一些。4°做好不要太長3天我是試過沒有問題再長不知道了。血凝塊就算了吧太難了結果不穩定。如果要分離血漿請在把血凍起來之前，其實越早越好否則有時候會溶血就麻煩，對提取DNA沒有影響，但是對提取血漿就問題大了。

DNA提取：
一般離心柱法提取比較純，片段短一些，損失大一些，沉淀法提取出來要長一些，效率比較高，估計沉淀法提取出來的是離心柱發的2-3倍量（注意了沉淀法有時候雜質太多70%沉淀這一步可以多1-2次）也可以自己配試劑提取摸索一下，我沒有試過，聽說不是很難。

我用過的試劑盒評價：
（試劑盒最好問一下保存液的成分）其實多數國產公司提取都沒有問題都好用。

1.  天根沉淀法和離心柱法——聽說是QIAGEN的技術當然QIAGEN非常好就是太貴根本沒有必要考慮有的政府部門錢多沒有地方花采用它：方便、簡單、比進口便宜，優點蛋白酶k可以放常溫，有個致命缺點就是提取的DNA保存時間很短。運氣不好似乎常溫下2小時就開始降解，有時候在4°放一周就降解了，讓人很煩，放-20反復解凍，幾次之后也不行了。（我有一批煩放了2個月都挺好，有一批才第二天就做不出來跑膠結果降解-連上前邊的降解500個左右氣啊）我寫信問過為什么了。他們回答是因為他們洗脫液（DNA保存液TB）成分里邊的問題，保存te就會好，你要保存你可以自己配TE，怎么服務的，說明書上也不寫出來，現在不敢用他們的了（還有他們的稍微貴一點，用便宜的好了），以前用的貨號DP-318。

2.   康為世紀的離心柱和沉淀法：方便、簡單、比天根的更便宜，DNA保存的時間似乎比天根的長，似乎4°一個月沒有問題，再長沒有試過（等試試再來補充因為現在才改用他們的），我認為洗脫液（DNA溶解液）似乎和天根不同，含有EDTA呵呵tris吧，4°1個月沒有問題我放過50多個樣本，我估計1年沒有問題，缺點蛋白酶k只能放-20要注意保存好

3.  DNA 抽提 Puregene 試劑盒（美國 Gentra 公）：是用沉淀法、方便簡單，保存試劑時間長，DNA放在溶解液里邊4°2年都沒有問題，就是有點貴，非常好用。后邊有個網友用了寶生物公司的DNA提取試劑盒也很好用，也很簡單，我自已倒是沒有用過，注意他的保存液體中有沒有EDTA。

總結：推薦后兩個吧其他試劑盒沒有用過，沉淀法300ul血可以做100次pcr，25ul體系，離心柱發法600ul血。

補充：解凍血稍微快一點好，例如37°解凍用蛋白酶k比試劑盒說明延長一點比較好。

提取好以后保存:比血液更保存的久，5年沒有問題，不過估計天根可能會有問題，因為他的TB成分有問題，溫度來說4°、-20°、-80°都可以但是-80°是最好了，不過4°凍融會損失DNA。

從成分上來說：

雙蒸水不好很容易降解特別在4°，ph8.0的水（加氫氧化鈉）：稍微好一點，在4°搞不好就一周降解，加點EDTA會好很多-EDTA我感覺2mmol就可以了最好每微升不要超過5mmmol-太多影響pcr，TE不錯可以放很長時間在4°至少一個月，一般te里邊就1mmolEDTA，也可以加到2，有時候可以保存1年沒有問題，用試劑盒看廠家提供的配方了，一般和這幾個差不多，又怕EDTA影響實驗又擔心不好保存可以用沒有加EDTA的TE。

檢測：可以測od值你搜索一下就知道了做點pcr一般影響不大-太差說明乙醇沉淀多做一次就好了，其實最好跑膠吧0.8-1的瓊脂糖，7v/cm的電壓跑15分鐘，看到一個跑得很慢的估計離孔21cm左右吧，大約100-20kb。濃度走個mark比一下亮度就可以了（4ul上樣）。

產率：人血100ul有3-6ug吧經驗估計看你保存的和樣本來源了。
ps1：提取基因組時候同時線粒體DNA也被提取了，我試過。

ps2：pcr美微升10ng運氣好就可以跑出來了，只要你電泳4ul上樣可以看得到條帶基本都可以做25ulpcr加1-6ulDNA

當pcr不穩地的時候可以多加點DNA嘗嘗有幫助。

ps3：提取組織中的DNA可以用trizol，順便也提取RNA，只提取的話用自己去查。

ps4：一般來說沉淀法300ul血加溶解液100ul，離心柱發500ul加100溶解液。

Ps5：提取血中RNA可以先提取淋巴細胞在，然后再從淋巴細胞里邊提取RNA-按一般的trizol方法即可，直接用血和trizol效果不好-我做的時候是這樣的。

ps6：離心柱法提取血的試劑盒來提取組織，呵呵省的買專門提取組織的了省點錢！！！稱量小于50-20mg的組織（20一般夠了）與EP管中，(括號內的可以省略，加了之后效果好產率高不少：打碎處理為細胞懸液，然后10,000rpm(～11,200×g)離心1 min，倒盡上清，，也可以稍微剪成小塊這樣倒是不復雜)加入200ul GS緩沖液，加入20-40ul 蛋白酶 K 溶液，加 150ul 緩沖液GB，充分顛倒混勻。56℃放置 4-7h左右4小時一般夠了，每個小時顛倒一次最好。后邊的步奏不說了要么是沉淀，要么過離型柱哈哈把提取血的來提組織省了錢啊！