減數分裂作圖實驗

實驗材料 酵母菌株

試劑、試劑盒 消解酶 100T

儀器、耗材 毛細吸管頭強力膠水光學玻璃纖維YPD平板YPD培養管

實驗步驟

第 1 天

顯微針的制備四分體解剖針可以通過手工拉制細玻璃絲或使用「技術和方案 23, 制備四分體解剖針」中描述的光學纖維玻璃絲來制備。將會演示針的準備過程并且提供給你一些必需品，以便你可以自己制備。針和固定器也可通過商業途徑獲得。

用消解酶處理在開始本課程前 3 天，指導教師會把二倍體菌株 3-3 接到孢子形成培養基上。在顯微鏡下觀察形成孢子的培養物，并辨別未形成孢子的細胞以及四孢子子囊，以及少于四個孢子的子囊。每個學生將安排 3 天時間用 4 個活的孢子來制備 20 個解剖了的四分體，并用消解酶的方法來處理細胞。在「技術和方案 22，四分體解剖」中描述了四分體的顯微操作。

第 3 天

完成四分體的解剖。

第 5 天

每個學生必須用無菌扁平牙簽和模板（附錄 D，平板劃線模板）制備兩塊上面有 4 個活孢子菌落（每塊板有 10 個四分體）的母板。每個平板上包括兩個親本對照菌株。

在 30°C 下過夜培養。

第 6 天

影印平板上的四分體到測試培養基影印母板到以下培養基上：YPD、SC-leu、SC-arg、SC-ade、SC-trp、YPD+cyh 和 6 個以上的 YPD 平板（在開始前見下面的提示）。第一塊 YPD 平板作為新鮮的母板留作后用。其余的 YPD 平板用于將孢子菌落與測試菌株的交配。所有平板在 30°C 下培養。

提示：從一塊原平板做 12 次影印是一個大的工作量。在 6 次影印后，在影印模具上放一塊新的絨墊，并用母板做新的影印。因為用了兩次母板，第一次用絨墊要輕些影印，以便第二次影印時在原板上還保留有細胞。每次影印后要檢查一下，應該能看到其相應于母板上排列方式的輕微的細胞沉淀。如果沒有看到，要再試一次。另一種方法:

孢子菌落接種到含有無菌水的一個微量滴定盤中，然后用多頭接種器，即多頭轉接技術 (froggingtechnique) 將這些細胞轉移到不同測試板上。在^J 和的菌株間能發生交叉給養（cross-feeding), 因此輕微地影印到 SC-trp 板上是重要的。

交配型和等位基因測試菌的準備在 5 ml 的 YPD 培養基中培養測試菌株 3-4 到 3-13。或者，在 YPD 培養基上制備大塊的測試菌株的菌斑。30°C 下過夜培養。

第 7 天

交配型測試菌苔的準備使用其中一種方法。

a. 離心 5 ml 的 3-4 和 3-5 菌株培養物（桌面離心機 2000r/min，5 min)。在一個無菌的旋蓋試管中用 4 mlYPD 重懸浮菌體。加 0.15 ml 無菌水和 0.15 ml 重懸的菌株 3-4 的培養物到兩塊 SD 平板（剩余細胞儲備在 4°C)。用無菌棒將菌體涂勻，水平放置平板，使平板晾干。同樣處理菌株 3-5。

b. 用收集棒從 YPD 平板上刮取菌株 3-4 的一個新鮮菌斑，重懸于 4 ml 的 YPD 液體培養基中。過夜培養使之細胞濃度達到過飽和。涂 0.2 ml 菌液到兩塊 SD 平板上。同樣處理菌株 3-5。液體揮干后，影印平板到菌苔上。

等位基因和互補測試菌苔的準備除 MATa 和 MATa 型測試菌株被置于同一塊平板外，這些菌苔的準備與在「交配型菌苔」中的方法同樣。準備 4 種類型的測試菌苔，并且每種準備兩塊。在 SC-ura-his 平板上涂開 arg4 測試菌苔（菌株 3-6 與 3-7 混合，菌株 3-8 與 3-9 混合）。對于 Trp 互補菌苔（菌株 3-10 與 3-11 混合，菌株 3-12 與 3-13 混合），將細胞涂到 SC-trp 平板上。在影印平板到菌苔上以前，讓液體變干。

復制平板到測試菌苔用 6 個前一天制備的四分體的 YPD 影印物作源影印到 6 個測試菌苔上。對于每個測試菌苔，均用一個新的絨墊，把 YPD 平板印在絨墊上，然后將測試菌苔平板印在絨墊上，以此來轉移四分體到測試菌苔上。測試平板在 30°C 下培養過夜。

第 9 天

影印 SC-um-his 平板上的等位基因測試菌苔到 SC-arg 平板上并且冷藏。在當日結束時，由實驗室助理收集平板，用 STRATAGENE 公司的 Stmtalmker7500|uJ 的紫外線燈（254nm) 照射。

分析交配型測試平板和 Trp 互補平板的生長情況。由于 tr 和缺陷菌株能與缺陷菌株共生，需要影印 SC-trp 平板到一塊新的 SC-trp 平板上并在第二天分析。

第 10/11 天

分析 arg4 等位基因測試平板及 Trp 互補平板。

第 11 天

確定在雜交中每種對標記發生分離后的 PD、NPD 和 T 型四分體的數量。在本實驗末尾的記錄單上記錄 PD/NPD/T 型資料。此外，記錄每個標記的第二次分裂分離的頻率。通過搜尋在酵母基因組數據庫（SGD;http://www.pathway,yeastgenome.org/) 中的關于每個基因圖譜的信息來確定每個基因與著絲粒間的距離。用收集的資料計算：

1) 每個分析基因與所有其他分析基因間的圖譜距離 2) 每個基因與它的著絲粒間距離（如何與 SGD 提供的信息相比較?）3) 所有我們研究的等位基因的基因轉換頻率（3:1 或 1:3 分離）第 14 天準備提交資料