分子克隆蛋白表達實驗指南（一）

目的基因克隆包括保存用全長基因(gene for saving, GS)和表達用全長基因(gene for expression, GE)兩部分。
  這兩部分所克隆的基因都是全長片段，但克隆的策略及目的不同。直接用精確克隆(及引物從基因CDS兩端開始)很難找到高效價的引物，且cDNA中目的基因很少，成功克隆出基因很困難。因此我們選擇在CDS兩端設計高效價引物，先將基因從cDNA文庫中克隆，將克隆插入T載體中。之后再設計一對用于精確克隆的引物，以插入目的基因的重組T載體為模板，克隆出用于表達的基因，插入T載體。GS目的基因的拷貝數很高，及時引物效價不高，仍然能獲得GE。
  全長基因難以獲得時(如GC含量較高)，可克隆目的基因中800～1000bp的片段用于表達。
  1．  細胞復蘇及培養
  a．  確定細胞復蘇用得培養液。培養液使用前37C水浴溫育。
  b．  預先準備10ml的相應培養液，用于洗滌復蘇細胞
  c．  從液氮中取出cell后，37C溫育至融化。開蓋前用酒精消毒
  d．  用移液管將復蘇細胞轉入step b中的培養液中洗滌，除去凍存cell中的DMSO
  e．  1000rpm，5min，去上清，輕輕振蕩重懸cell，加入1ml左右新培養液，混勻
  f．   轉移cell至含20ml左右培養液的培養瓶中，蓋口不能擰緊，37C培養至培養瓶壁貼滿cell
  g．  培養約2－3天至細胞貼滿培養瓶壁時將細胞傳代，分裝兩個培養瓶，一個保種，一個抽RNA。
  
  2．  RNA抽提

  懸浮細胞            組織器官                   單層貼壁細胞

  （5-10X106）        (50-100mg)                     107

  1000rpm，5min離心       勻漿           胰酶消化至細胞懸浮，1000rpm，5min離心

                       PBS洗滌兩次(PBS無須DEPC處理)，

  1mlTRI REAGENT 裂解，用槍吹打混勻，室溫5min
                      可-20度保存留用，or
  200ul 氯仿（劇烈搖勻vortex，室溫5min,ice 5 min）

  12000g 15min 4℃
      取水相（500ul以上）加入等體積異丙醇(室溫5min,ice 5min)

  加完異丙醇立即上下顛倒5－10次混勻，若同時抽多管，則每次加完一管后都應立即混勻
   12000g 15min 4℃
                      傾倒除去上清，并用槍吸干

  1ml 75%乙醇 wash一次，用槍吹打均勻

  7500g， 5 min  4℃
  去上清，盡量用槍吸盡

  air dry the RNA pellet ,2～3min
  do not let RNA turn translucent

  50 ul ddH2O (DEPC treated) dissolve by a pipet

  檢測O.D值/1% agsrose 電泳
     RNA分裝成10ul后凍存，防止反復凍融使RNA降解。取RNA時一定帶上手套，避免手上的RNA酶污染。
    抽提RNA后應跑核酸電泳檢測RNA純度及降解程度。一般RNA抽提后應在700bp～1.5kb范圍內有兩條清晰的帶。
  3．  Reverse Transcription
  System（40ul）
        5X buffer                  8ul
        0.1M DTT                 4ul
        dNTPs(10mM)             8ul
        RNAse inhibitor             0.5ul
        Superscriptase                1ul
        Oligo（dT）12-16 (0.5ug/ul) 1 ul
  Sample RNA (4ug)        4ug
        DEPC H2O                 add to 40ul
  將Oligo
  dT與RNA，DEPC水混勻后，70C水浴10min(封口)，冰浴2-3min，加入其余上述混合液，37C水浴1.5h，95C水浴5min(封口)，冰浴，-20C
  store。RT-PCR水浴時封口膜封EP管，防止水蒸發影響反應體系。
  RT-PCR后用持家基因HPRT引物PCR，檢測RNA抽提質量。HPRT退火溫度60C左右。HPRT長度較小，為與引物二聚體區別，PCR時需做一不加模板的空白對照