分子雜交——Southern基因檢測2

C．轉移按凝膠的大小剪裁NC膜或尼龍膜并剪去一角作為標記，水浸濕后，浸入轉移液中5min。剪一張比膜稍寬的長條Whatman 3mm濾紙作為鹽橋，再按凝膠的尺寸剪3-5張濾紙和大量的紙巾備用。按下圖所示進行轉移。（ 轉移過程一般需要8-24hr，每隔數hr換掉已經濕掉的紙巾。轉移液用20×SSC。注意在膜與膠之間不能有氣泡。整個操作過程中要防止膜上沾染其他污物。）
D. 轉移結束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液數min，洗去膜上沾染的凝膠顆粒，置于兩張濾紙之間，80°C烘2hr，然后將NC膜夾在兩層濾紙間，保存于干燥處。
5、探針標記
進行Southern 雜交的探針一般用放射性物質標記或用地高辛標記。放射性標記靈敏度高，效果好；地高辛標記沒有半衰期，安全性好。這里介紹放射性標記。
探針的標記方法有隨機引物法、切口平移法和末端標記法，有一些試劑盒可供選擇，操作也很簡單。
以下為Promega公司隨機引物試劑盒提供的標記步驟：
A．取25-50ng模板DNA于0.5ml離心管中，100℃變性5min，立即置冰浴。
B．在另一個0.5ml離心管中加入：
Labeling 5×buffer （含有隨機引物） 10μl
dNTPmix 2μl
(含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)
BSA（小牛血清白蛋白） 2μl
[a-32P]dATP 3μl
Klenow酶 5U
C．將變性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl，混勻。室溫或37℃ 1hr。
D．加50μl 終止緩沖液終止反應。
標記后的探針可以直接使用或過柱純化后使用。由于a-32P的半衰期只有14天，所以標記好的探針應盡快使用。探針的比活性最好大于109計數/分/μl。
6、雜交
Southern 雜交一般采取的是液-固雜交方式，即探針為液相，被雜交DNA為固相。雜交發生于一定條件的溶液（雜交液）中并需要一定的溫度，可以用雜交瓶或雜交袋并使液體不斷的在膜上流動。雜交液可以自制或從公司購買，不同的雜交液配方相差較大，雜交溫度也不同。下面給出的為一雜交液配方：
PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50%甲酰胺。該雜交液的雜交溫度為42℃。
A．預雜交
NC膜浸入2×SSC中5min，在雜交瓶中加入雜交液（8cm×8 cm的膜加5ml即可），將膜的背面貼緊雜交瓶壁，正面朝向雜交液。放入42℃雜交爐中，使雜交體系升到42℃。取經超聲粉碎的鮭魚精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加熱變性5min，迅速加到雜交瓶中，使其濃度達到100μg/ml。繼續雜交4hr。鮭魚精DNA的作用是封閉NC膜上沒有DNA轉移的位點，降低雜交背景、提高雜交特異性。
B．雜交
倒出預雜交的雜交液，換入等量新的已升溫至42℃的雜交液，同樣加入變性的鮭魚精DNA。將探針100℃加熱5min，使其變性，迅速加到雜交瓶中。42℃雜交過夜。
7、洗膜與檢測
取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列條件洗膜：
2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min；
0.1×SSC/0.1% SDS，56℃，10min。
在洗膜的過程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強度。實踐證明，當放射強度指示數值較環境背景高1-2倍時，是洗膜的終止點。上述洗膜過程無論在哪一步達到終點，都必須停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水份，并用保鮮膜包裹，注意保鮮膜與NC膜之間不能有氣泡。將膜正面向上，放入暗盒中（加雙側增感屏），在暗室的紅光下，貼覆兩張X光片，每一片都用透明膠帶固定，合上暗盒，置-70℃低溫冰箱中曝光。根據信號強弱決定曝光時間，一般在1-3天時間。洗片時，先洗一張X光片，若感光偏弱，則再多加兩天曝光時間，再洗第二張片子。
影響Southern雜交實驗的因素很多，主要有：DNA純度、酶切效率、電泳分離效果、轉移效率、探針比活性和洗膜終止點等。

8、注意事項

A. 要取得好的轉移和雜交效果，應根據DNA 分子的大小，適當調整變性時間。對于分子量較大的DNA片段（大于15kb），可在變性前用0.2M HCl預處理10min使其脫嘌呤。

B. 轉移用的NC膜要預先在雙蒸水中浸泡使其濕透，否則會影響轉膜效果；不可用手觸摸NC膜，否則影響DNA的轉移及與膜的結合。

C. 轉移時，凝膠的四周用Parafilm蠟膜封嚴，防止在轉移過程中產生短路，影響轉移效率，同時注意NC膜與凝膠及濾紙間不能留有氣泡，以免影響轉移。

D. 注意同位素的安全使用。