利用納米孔測序技術揭示基因表達的染色質調控基礎

　　作為染色質的基本單元，核小體由大約147 bp的DNA和組蛋白八聚體（H2A, H2B, H3和H4）組成。核小體的動態定位和折疊組織會產生兩種不同的染色質狀態：“開放”（open）和“閉合”（closed）。核小體的定位和染色質狀態的動態變化對以DNA為模板的生物學過程（比如，轉錄、DNA復制和修復）具有關鍵的調控作用。

　　基于第二代“短讀長”測序技術（比如，Illumina測序）的方法（比如，MNase-seq、DNase-seq、ATAC-seq、NOMe-seq、MPE-seq、ChIP-seq和FAIRE-seq）已經被廣泛地應用于核小體位置和染色質狀態的測定。然而，這些方法只能測定“細胞群體水平、短距離”的核小體占據和染色質狀態。盡管最近單細胞測序技術已經被整合到這些方法中，并且揭示了細胞群體中染色質狀態的異質性，但由于單細胞測序的低基因組覆蓋度以及第二代測序長度的限制，目前我們仍舊對細胞群體中染色質狀態異質性以及長距離的染色質動態變化的缺乏了解。值得注意的是，美國太平洋生物科學公司（Pacific Biosciences，PacBio）開發的“單分子、實時”測序（single-moleculereal-time）技術以及英國牛津納米孔技術公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）技術開發的納米孔“單分子、實時”測序技術，不僅極大地增加了測序的長度（達到數百萬個堿基對），而且提供了測序DNA模板的“單DNA分子”信息。

　　2019年6月14日，美國俄亥俄州立大學（OhioState University）的區健輝（Kin Fai Au）研究組在Genome Research上在線發表研究論文Single-molecule long-read sequencing reveals thechromatin basis of gene expression，結合外源甲基轉移酶處理和牛津納米孔測序技術，開發了一種用于測定“單分子、長距離”水平的核小體定位和染色質狀態的方法，MeSMLR-seq（methyltransferase treatmentfollowed by single-molecule long-read sequencing）。

　　該實驗方法主要包括兩部分：第一，利用GpC特異的甲基轉移酶（M.CviPI）將位于裸露DNA上的胞嘧啶（cytosine）轉換成5-甲基胞嘧啶（5mC）；第二，利用牛津納米孔測序技術（Oxford Nanopore Technologies）進行5mC的直接檢測，隨后基于5mC的分布進行核小體定位和染色質狀態分析。同時，作者也開發了相應的生物信息學工具NP-SMLR （https://github.com/Au-Lab/NP-SMLR），用于5mC的檢測，以及核小體的定位分析。

　　研究人員將MeSMLR-seq應用于單倍體的酵母細胞（一個基因組拷貝），實現“單個DNA分子”（single DNA molecule）對“單個細胞”（single cell）的模擬。借助于模擬數據，作者首先證實了MeSMLR-seq在單分子水平5mC檢測和核小體定位分析方面的準確性和穩健性。接著，研究者展示了MeSMLR-seq在群體細胞水平核小體定位和染色質狀態分析方面，與已有方法（包括MNase-seq、ATAC-seq和DNase-seq）具有高度的一致性。

　　借助于MeSMLR-seq的“單分子、長距離”優勢，研究者揭示了轉錄起始位點周圍的核小體組織規則：對于沉默轉錄的基因，在一個細胞群體中核小體定位（nucleosome positioning）具有更大的異質性（heterogeneity）；而對于激活轉錄的基因，核小體的間距分布（nucleosome spacing）具有更高的均一性（uniformity）。

　　進一步，結合單細胞轉錄組數據（single-cell RNA-seq），作者定量地揭示了染色質開放狀態和基因轉錄活性的正相關關系。

　　通過量化基因啟動子區的開放程度，研究者分析了轉錄重編程過程中，染色質狀態的協同變化。最后，作者調查了兩個在基因組位置臨近的葡萄糖轉運基因（HXT6和HXT3）在應答葡萄糖濃度變化時，呈現出的轉錄活性以及“偶聯”的染色質狀態的變化。

　　總之，該研究開發了一種用于“單分子、長距離”水平染色質狀態分析的新方法，為研究基因表達的染色質調控提供了基礎。除了單倍體的酵母細胞，MeSMLR-seq方法也可以用于多倍體高等生物（比如，人和小鼠）細胞中DNA甲基化以及染色質狀態的研究。最近的一些研究表明，牛津納米孔測序可以直接鑒定內源的CpG特異的DNA 5mC。MeSMLR-seq的單個DNA分子可以同時測量DNA甲基化（內源CpG特異的5mC），以及核小體定位和染色質狀態（基于外源GpC特異的5mC）。

　　該研究（MeSMLR-seq）是區健輝課題組將第三代測序技術應用于表觀遺傳學研究的第一個工作，區健輝課題組的王運浩博士和王安琪博士為共同第一作者。

　　此外，區健輝課題組長期致力于第三代測序技術領域的研究，已經開發了一批專門用于第三代轉錄組測序數據分析的生物信息學工具，包括IDP（轉錄組構建）、IDP-fusion（融合基因鑒定）、IDP-ASE（等位基因特異性表達分析）、IDP-denovo（轉錄組組裝）、IDP-APA（選擇性多聚腺苷酸化分析）以及其他一些用于各種復雜轉錄事件分析的工具（https://github.com/yunhaowang）。

　　論文鏈接：

　　https://genome.cshlp.org/content/early/2019/06/14/gr.251116.119.abstract